Usando um método de auto-organização, desenvolvemos um protocolo com a adição de COCO que poderia aumentar significativamente a geração de fotorreceptores.
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Artigo de método
Indução Dirigida de Organoides da Retina a partir de Células-Tronco Pluripotentes Humanas
Neste artigo
Resumo
Resumo
O transplante de células da retina é uma abordagem terapêutica promissora, que poderia restaurar a arquitetura da retina e estabilizar ou mesmo melhorar as capacidades visuais da retina degenerada. No entanto, o progresso na terapia de reposição celular atualmente enfrenta os desafios de exigir uma fonte pronta para uso de retinas humanas padronizadas e de alta qualidade. Portanto, um protocolo fácil e estável é necessário para os experimentos. Aqui, desenvolvemos um protocolo otimizado, baseado em um método de auto-organização com o uso de moléculas exógenas e reagente A, bem como excisão manual para gerar os organoides tridimensionais da retina humana (RO). As RO derivadas de células-tronco pluripotentes humanas (PSCs) expressam marcadores específicos para fotorreceptores. Com a adição de COCO, um antagonista multifuncional, a eficiência de diferenciação de precursores e cones fotorreceptores é significativamente aumentada. O uso eficiente deste sistema, que tem os benefícios de linhagens celulares e células primárias, e sem os problemas de fornecimento associados a este último, poderia produzir células retinianas confluentes, especialmente fotorreceptores. Assim, a diferenciação de PSCs para RO fornece uma plataforma ótima e biorrelevante para modelagem de doenças, triagem de medicamentos e transplante de células.
Introdução
As células-tronco pluripotentes (PSCs) são caracterizadas por sua auto-renovação e capacidade de se diferenciar em todos os tipos de células somáticas. Assim, os organoides derivados de PSCs tornaram-se um recurso importante na pesquisa em medicina regenerativa. A degeneração da retina é caracterizada pela perda de fotorreceptores (bastonetes e cones) e epitélio pigmentar da retina. A substituição das células da retina pode ser um tratamento encorajador para esta doença. No entanto, não é viável obter retinas humanas para pesquisa e terapia de doenças. Portanto, os organoides da retina (ROs) derivados de PSCs, que recapitulam de forma eficaz e bem-sucedida as células ....
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Protocolo
Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética institucional do Beijing Tongren Hospital, Capital Medical University. As hESCs H9 foram obtidas do WiCell Research Institute e geneticamente modificadas para a linhagem celular marcada com tdTomato.
1. Geração de ROs humanas
- Cultive os hESCs em condições livres de alimentadores.
- Revestir um poço de uma placa de 6 poços com 1 mL de 0,1 mg/mL de reagente A (Tabela de Materiais) a 37 °C por pelo menos meia hora seguindo as instruções do fabricante. Descongelar uma alíquota de 1x106 hESCs.
NOTA: Preparar 3 mL de reagente B pré-aquecido (Tabela....
- Revestir um poço de uma placa de 6 poços com 1 mL de 0,1 mg/mL de reagente A (Tabela de Materiais) a 37 °C por pelo menos meia hora seguindo as instruções do fabricante. Descongelar uma alíquota de 1x106 hESCs.
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Resultados
A ilustração esquemática retrata o protocolo de diferenciação para melhorar as células precursoras com COCO (Figura 1). De PSC a ROs, inúmeros detalhes podem causar variações de resultados. Recomenda-se registrar cada etapa e até mesmo o número de catálogo e o número de lote de cada meio para acompanhar todo o procedimento.
Aqui, fornecemos imagens de campo brilhante para os dias 6, 12, 18 e 45 (Figura 2). No dia 6, os organoides gera.......
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Discussão
A diferenciação organoide retiniana é um método desejável para a geração de amplas células funcionais da retina. A RO é um composto de diferentes células da retina, como células ganglionares, células bipolares e fotorreceptores, geradas por células-tronco pluripotentes em direção à retina neural 4,5,8,9. Embora as ROs confluentes possam ser colhidas, é demorado, o que pode exigir longos período.......
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Agradecimentos
Agradecemos aos membros do laboratório 502 por seus apoios técnicos e comentários úteis sobre o manuscrito. Este trabalho foi parcialmente apoiado pela Fundação Municipal de Ciências Naturais de Pequim (Z200014) e pelo Programa Nacional de P&D da China (2017YFA0105300).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 2-mercaptoetanol | Life Technologies | 21985-023 | |
| COCO | R& D Systems | 3047-CC-050 | DAN Família de domínios de antagonistas BMP |
| DMEM / F-12 | Gibco | 10565-042 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| DPBS | Gibco | C141905005BT | |
| EDTA | Thermo | 15575020 | |
| Fetal Soro Bovino (FBS), Qualificado para Células-Tronco Embrionárias Humanas | Indústria Biológica | 04-002-1A | |
| GMEM | Gibco | 11710-035 | |
| KnockOut Substituição de Soro - Multi-Espécies | Gibco | A3181502 | |
| MEM Solução de Aminoácidos Não Essenciais (100X) | sigma | M7145 | |
| Caneta Strep | Gibco | 15140-122 | |
| Primesurface 96 V-plate | Sbio | MS9096SZ | Agregação de células em 1.2.7 |
| Piruvato | Sigma | S8636 | |
| Reagente A | BD | 356231 | Matrigel em 1.1.1 |
| Reagente B | StemCell | 5990 | mTeSR- E8, PSCs meio basal em 1.1.2 |
| Reagente C | Gibco | 12563-011 | TrypLE Express em 1.2 |
| Reagente D | Roche | 11284932001 | DNase I, em 1.2 |
| Ácido retinóico | Sigma | R2625-100MG | |
| SAG | Enzo Life Science | ALX-270-426-M001 | |
| Suplemento 1 | Life Technologies | 17502-048 | N-2 Suplemento (100X), Líquido, flexível em medum III |
| Taurina | Sigma | T-8691-25G | |
| Tripsina-EDTA (0,25%), vermelho de fenol | Gibco | 25200056 | dissociação de organoides em 2.1.3 |
| Wnt Antagonista I, IWR-1-endo - Calbiochem | Sigma | 681669 | inibidor Wnt |
| Y-27632 2HCl | Selleck | S1049 |
Referências
- Xie, H., et al. Chromatin accessibility analysis reveals regulatory dynamics of developing human retina and hiPSC-derived retinal organoids. Science Advances. 6 (6), 5247(2020).
- Lu, Y. F., et al.
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Reimpressões e permissões
