Gerichtete Induktion retinaler Organoide aus humanen pluripotenten Stammzellen
Summary
Mit einer selbstorganisierenden Methode entwickeln wir ein Protokoll mit dem Zusatz von COCO, das die Bildung von Photorezeptoren signifikant erhöhen könnte.
Abstract
Die retinale Zelltransplantation ist ein vielversprechender Therapieansatz, der die Netzhautarchitektur wiederherstellen und die Sehfähigkeit der degenerierten Netzhaut stabilisieren oder sogar verbessern könnte. Dennoch steht der Fortschritt in der Zellersatztherapie derzeit vor der Herausforderung, eine handelsübliche Quelle für qualitativ hochwertige und standardisierte menschliche Netzhäute zu benötigen. Daher ist ein einfaches und stabiles Protokoll für die Experimente erforderlich. Hier entwickeln wir ein optimiertes Protokoll, basierend auf einer selbstorganisierenden Methode unter Verwendung von exogenen Molekülen und Reagenz A sowie manueller Exzision zur Erzeugung der dreidimensionalen menschlichen Netzhautorganoide (RO). Die von humanen pluripotenten Stammzellen (PSCs) abgeleiteten RO exprimieren spezifische Marker für Photorezeptoren. Mit der Zugabe von COCO, einem multifunktionalen Antagonisten, wird die Differenzierungseffizienz von Photorezeptorvorläufern und Zapfen signifikant erhöht. Die effiziente Nutzung dieses Systems, das die Vorteile von Zelllinien und Primärzellen hat, und ohne die damit verbundenen Beschaffungsprobleme, könnte konfluente Netzhautzellen, insbesondere Photorezeptoren, produzieren. Somit bietet die Differenzierung von PSCs zu RO eine optimale und biorelevante Plattform für Krankheitsmodellierung, Wirkstoffscreening und Zelltransplantation.
Introduction
Pluripotente Stammzellen (PSCs) zeichnen sich durch ihre Selbsterneuerung und die Fähigkeit aus, sich in alle Arten von Körperzellen zu differenzieren. Daher sind Organoide, die von PSCs abgeleitet sind, zu einer wichtigen Ressource in der Forschung der regenerativen Medizin geworden. Die Netzhautdegeneration ist durch den Verlust von Photorezeptoren (Stäbchen und Zapfen) und des retinalen Pigmentepithels gekennzeichnet. Der retinale Zellersatz könnte eine ermutigende Behandlung für diese Krankheit sein. Es ist jedoch nicht möglich, menschliche Netzhäute für die Erforschung und Therapie von Krankheiten zu erhalten. Daher sind retinale Organoide (ROs), die von PSCs abgeleitet sind und die mehrschichtige native Netzhautzellen effektiv und erfolgreich rekapitulieren, für die Grundlagen- und translationale Forschung von Vorteil 1,2,3. Unsere Forschung konzentriert sich auf die RO-Differenzierung, um ausreichend und qualitativ hochwertige Zellen für die Untersuchung der Netzhautdegenerationbereitzustellen 4.
Methoden zur Differenzierung von ROs entstehen kontinuierlich, wobei das Sasai-Labor 2012 eine dreidimensionale (3D) Suspensionsdifferenzierung entwickelt hat5. Wir haben den CRX-tdTomato-Tag in die menschlichen embryonalen Stammzellen (hES-Zellen) eingeführt, um die Photorezeptor-Vorläuferzellen spezifisch zu verfolgen, und modifizierten die Methode durch den Zusatz von COCO, einem multifunktionalen Antagonisten der Wnt-, TGF-β- und BMP-Signalwege6. Es wurde gezeigt, dass COCO die Differenzierungseffizienz von Photorezeptorvorläufern und Zapfen effizient verbessert 6,7.
Insgesamt haben wir durch die Modifikation der klassischen Differenzierungsmethode ein zugängliches Protokoll entwickelt, um reichlich Photorezeptorvorläufer und Zapfen aus menschlichen ROs zu gewinnen, um die mit den Photorezeptoren verbundenen Netzhauterkrankungen durch Laboruntersuchungen und für die weitere klinische Anwendung / Transplantation zu analysieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die retinale Organoiddifferenzierung ist eine wünschenswerte Methode zur Erzeugung reichlich funktionsfähiger Netzhautzellen. Die RO ist ein Verbund aus verschiedenen Netzhautzellen, wie Ganglienzellen, bipolaren Zellen und Photorezeptoren, die von pluripotenten Stammzellen in Richtung der neuronalen Netzhaut 4,5,8,9 erzeugt werden. Obwohl konfluente ROs geerntet werden könnten, ist es zeita…
Acknowledgements
Wir danken den Mitgliedern des Labors 502 für ihre technische Unterstützung und hilfreichen Kommentare zum Manuskript. Diese Arbeit wurde teilweise von der Beijing Municipal Natural Science Foundation (Z200014) und dem National Key R&D Program of China (2017YFA0105300) unterstützt.
Materials
| 2-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | |
| COCO | R&D Systems | 3047-CC-050 | DAN Domain family of BMP antagonists |
| DMEM/F-12 | Gibco | 10565-042 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| DPBS | Gibco | C141905005BT | |
| EDTA | Thermo | 15575020 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Qualified for Human Embryonic Stem Cells | Biological Industry | 04-002-1A | |
| GMEM | Gibco | 11710-035 | |
| KnockOut Serum Replacement-Multi-Species | Gibco | A3181502 | |
| MEM Non-essential Amino Acid Solution (100X) | sigma | M7145 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| Primesurface 96 V-plate | Sbio | MS9096SZ | Cell aggregation in 1.2.7 |
| Pyruvate | Sigma | S8636 | |
| Reagent A | BD | 356231 | Matrigel in 1.1.1 |
| Reagent B | StemCell | 5990 | mTeSR- E8 , PSCs basal medium in 1.1.2 |
| Reagent C | Gibco | 12563-011 | TrypLE Express in 1.2 |
| Reagent D | Roche | 11284932001 | DNase I , in 1.2 |
| Retinoic acid | Sigma | R2625-100MG | |
| SAG | Enzo Life Science | ALX-270-426-M001 | |
| Supplement 1 | Life Technologies | 17502-048 | N-2 Supplement (100X), Liquid, supplemet in medum III |
| Taurine | Sigma | T-8691-25G | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200056 | organoids dissociation in 2.1.3 |
| Wnt Antagonist I, IWR-1-endo – Calbiochem | Sigma | 681669 | Wnt inhibitor |
| Y-27632 2HCl | Selleck | S1049 |
Referências
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