Produktion av mänskliga CRISPR-konstruerade CAR-T-celler
Summary
Här presenterar vi ett protokoll för genredigering i primära mänskliga T-celler med CRISPR Cas Technology för att modifiera CAR-T-celler.
Abstract
Adoptivcellsterapier med chimeriska antigenreceptor T-celler (CAR-T- celler) har visat anmärkningsvärd klinisk effekt hos patienter med hematologiska maligniteter och undersöks för närvarande för olika solida tumörer. CAR-T-celler genereras genom att ta bort T-celler från patientens blod och konstruera dem för att uttrycka en syntetisk immunreceptor som omdirigerar T-cellerna för att känna igen och eliminera måltumörceller. Genredigering av CAR-T-celler har potential att förbättra säkerheten för nuvarande CAR-T-cellterapier och ytterligare öka effekten av CAR-T-celler. Här beskriver vi metoder för aktivering, expansion och karakterisering av mänskliga CRISPR-konstruerade CD19-regisserade CAR-T-celler. Detta omfattar transduktion av car lentiviral vektor och användning av enkel guide RNA (sgRNA) och Cas9 endonuclease för att rikta gener av intresse i T-celler. De metoder som beskrivs i detta protokoll kan tillämpas universellt på andra CAR-konstruktioner och målgener utöver de som används för denna studie. Dessutom diskuterar detta protokoll strategier för gRNA design, bly gRNA urval och mål gen knockout validering för att reproducerbart uppnå hög effektivitet, multiplex CRISPR-Cas9 ingenjörskonst av kliniska kvalitet mänskliga T celler.
Introduction
Chimeric antigen receptor (CAR)-T cellterapi har revolutionerat området adoptivcell terapier och cancer immunterapi. CAR-T-celler är konstruerade T-celler som uttrycker en syntetisk immunreceptor som kombinerar ett antigenspecifikt antikroppsfragment med signaldomäner som härrör från TCRzeta-kedjan och costimulatoriska domäner som är nödvändiga och tillräckliga för T-cellsaktivering och kostimulering1,2,3,4 . Tillverkningen av CAR-T-celler börjar med att extrahera patientens egna T-celler, följt av ex vivo viral transduktion av CAR-modulen och expansion av CAR-T-cellprodukten med magnetiska pärlor som fungerar som artificiella antigen som presenterar celler5. Utökade CAR-T celler återinfuseras i patienten där de kan instänka, eliminera mål tumörceller och även kvarstå i flera år efter infusion6,7,8. Även om CAR-T cellterapi har resulterat i anmärkningsvärda svarsfrekvenser i B-cells maligniteter, har klinisk framgång för solida tumörer utmanats av flera faktorer inklusive dålig T-cellsinfiltration9, en immunsuppressiv tumörmikromiljö10,antigentäckning och specificitet, och CAR-T-cellsdysfunktion11,12 . En annan begränsning av nuvarande CAR-T cell terapi inkluderar användning av autologa T-celler. Efter flera omgångar av kemoterapi och hög tumör börda, CAR-T celler kan vara av dålig kvalitet jämfört med allogena CAR-T produkter från friska givare utöver tid och kostnad i samband med tillverkning av autolog CAR-T celler. Genredigering av CAR-T-cellprodukten från CRISPR/Cas9 representerar en ny strategi för att övervinna nuvarande begränsningar av CAR-T-celler13,14,15,16,17.
CRISPR/Cas9 är ett tvåkomponentsystem som kan användas för riktad genomredigering i däggdjursceller18,19. Crispr-associerade endonukleas cas9 kan inducera platsspecifika dubbelsträngsbrytningar som styrs av små RNAs genom basparning medmål-DNA-sekvensen 20. I avsaknad av en reparationsmall repareras dubbelsträngsbrytningar av den felbenägna nonhomologous end joining (NHEJ) -vägen, vilket resulterar i frameshift mutationer eller för tidigt stopp kodon genom insättnings- och borttagningsmutationer (INDELs)19,20,21. Effektivitet, användarvänlighet, kostnadseffektivitet och förmågan till multiplexgenomredigering gör CRISPR/Cas9 till ett kraftfullt verktyg för att förbättra effektiviteten och säkerheten hos autologa och allogena CAR-T-celler. Den här metoden kan också användas för att redigera TCR-riktade T-celler genom att ersätta CAR-konstruktionen med en TCR. Dessutom kan allogena CAR-T-celler som har begränsad potential att orsaka transplantat kontra värdsjukdom också genereras genom genredigering av TCR, b2m och HLA locus.
I detta protokoll visar vi hur CRISPR-teknik av T-celler kan kombineras med viral vektor medierad leverans av CAR-Transgene för att generera genomreigerade CAR-T-cellprodukter med förbättrad effektivitet och säkerhet. Ett schematiskt diagram över hela processen visas i figur 1. Med hjälp av detta tillvägagångssätt har vi visat hög effektivitet gen knockout i primära mänskliga CAR-T celler. I figur 2A beskrivs i detalj tidslinjen för varje steg för redigering och tillverkning av T-celler. Strategier för guide RNA design och knockout validering diskuteras också för att tillämpa detta tillvägagångssätt på olika mål gener.
Protocol
Representative Results
Discussion
Här beskriver vi metoder för genredigering av CAR-T-celler med CRISPR Cas9-teknik och tillverkar produkter för att ytterligare testa för funktion och effektivitet. Ovanstående protokoll har optimerats för att utföra CRIPSR genredigering i primära mänskliga T-celler i kombination med tekniska T-celler med chimeriska antigenreceptorer. Detta protokoll möjliggör hög knockout effektivitet med minimal variabilitet mellan givare och givare. Modifiering med CRISPR kan förbättra både effekten och säkerheten hos C…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi erkänner human immunologi kärnan för att tillhandahålla normala givare T celler och flöde cytometri kärnan vid University of Pennsylvania.
Materials
| 4D-Nucleofactor Core Unit | Lonza | AAF-1002B | |
| 4D-Nucleofactor X-Unit | Lonza | AAF-1002X | |
| Accuprime Pfx Supermix | ThermoFisher | 12344040 | |
| Beckman Optima XPN ultracentrifuge | Beckman Coulter | ||
| Brilliant Violet 605 anti-human CD3 Antibody | Biolegend | 317322 | Clone OKT3 |
| BV711 Anti-human PD1 | Biolegend | Clone EH12.2H7 | |
| Cas9-Electroporation enhancers | IDT | 1075915 | |
| CD3/CD28 Dynabeads | ThermoFisher | 40203D | |
| CD4+ T cell isolation Kit | StemCell technologies | 15062 | |
| CD8+ T cell isolation Kit | StemCell technologies | 15063 | |
| Corning 0.45 micron vacuum filter/bottle | Corning | 430768 | |
| Corning T150 cell culture flask | Millipore Sigma | CLS430825 | |
| DMSO | Millipore Sigma | D2650 | |
| DNAeasy Blood and Tissue Kit | Qiagen | 69504 | |
| DynaMag Magnet | ThermoFisher | 12321D | |
| Glutamax supplement | ThermoFisher | 35050061 | |
| HEK293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
| HEPES (1 M) | ThermoFisher | 15630080 | |
| huIL-15 | PeproTech | 200-15 | |
| huIL-7 | PeproTech | 200-07 | |
| Lipofectamine 2000 | ThermoFisher | 11668019 | |
| Nucleospin Gel and PCR cleanup | Takara | 740609.25 | |
| Opti-MEM | ThermoFisher | 31985062 | |
| P3 Primary cell 4D-nucleofactor X Kit L | Lonza | V4XP-3024 | |
| Penicilin-Streptomycin-Glutamine | ThermoFisher | 10378016 | |
| pTRPE expression Plasmid | in house | ||
| Rabbit Anti-Mouse FMC63 scFv Monoclonal Antibody, (R19M), PE | CytoArt | 200105 | |
| RPMI1640 | ThermoFisher | 12633012 | |
| sgRNA | IDT | ||
| Spy Fi Cas9 | Aldevron | 9214 | |
| Ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 326823 | |
| Viral packaging mix | in house | ||
| X-Vivo-15 Media | Lonza | BE02-060F |
Referências
- Kowolik, C. M., et al. CD28 costimulation provided through a CD19-specific chimeric antigen receptor enhances in vivo persistence and antitumor efficacy of adoptively transferred T cells. Pesquisa do Câncer. 66 (22), 10995-11004 (2006).
- Krause, A., et al. Antigen-dependent CD28 signaling selectively enhances survival and proliferation in genetically modified activated human primary T lymphocytes. The Journal of Experimental Medicine. 188 (4), 619-626 (1998).
- Kuwana, Y., et al. Expression of chimeric receptor composed of immunoglobulin-derived V resions and T-cell receptor-derived C regions. Biochemical and biophysical research Communications. 149 (3), 960-968 (1987).
- Maher, J., Brentjens, R. J., Gunset, G., Rivière, I., Sadelain, M. Human T-lymphocyte cytotoxicity and proliferation directed by a single chimeric TCRζ/CD28 receptor. Nature Biotechnology. 20 (1), 70-75 (2002).
- Levine, B. L., Miskin, J., Wonnacott, K., Keir, C. Global manufacturing of CAR-T cell therapy. Molecular Therapy-Methods & Clinical Development. 4, 92-101 (2017).
- Neelapu, S. S., et al. Axicabtagene ciloleucel CAR-T-cell therapy in refractory large B-cell lymphoma. New England Journal of Medicine. 377 (26), 2531-2544 (2017).
- Porter, D. L., et al. Chimeric antigen receptor T cells persist and induce sustained remissions in relapsed refractory chronic lymphocytic leukemia. Science Translational Medicine. 7 (303), 139 (2015).
- Maude, S. L., et al. Chimeric antigen receptor T cells for sustained remissions in leukemia. New England Journal of Medicine. 371 (16), 1507-1517 (2014).
- Melero, I., Rouzaut, A., Motz, G. T., Coukos, G. T-cell and NK-cell infiltration into solid tumors: a key limiting factor for efficacious cancer immunotherapy. Cancer Discovery. 4 (5), 522-526 (2014).
- Mohammed, S., et al. Improving chimeric antigen receptor-modified T cell function by reversing the immunosuppressive tumor microenvironment of pancreatic cancer. Molecular Therapy. 25 (1), 249-258 (2017).
- Moon, E. K., et al. Multifactorial T-cell hypofunction that is reversible can limit the efficacy of chimeric antigen receptor-transduced human T cells in solid tumors. Clinical Cancer Research. 20 (16), 4262-4273 (2014).
- Beatty, G. L., O’Hara, M. Chimeric antigen receptor-modified T cells for the treatment of solid tumors: defining the challenges and next steps. Pharmacology & Therapeutics. 166, 30-39 (2016).
- Stadtmauer, E. A., et al. CRISPR-engineered T cells in patients with refractory cancer. Science. 367 (6481), (2020).
- MacLeod, D. T., et al. Integration of a CD19 CAR into the TCR alpha chain locus streamlines production of allogeneic gene-edited CAR-T cells. Molecular Therapy. 25 (4), 949-961 (2017).
- Ren, J., et al. Multiplex genome editing to generate universal CAR-T cells resistant to PD1 inhibition. Clinical Cancer Research. 23 (9), 2255-2266 (2017).
- Ureña-Bailén, G., et al. CRISPR/Cas9 technology: towards a new generation of improved CAR-T cells for anticancer therapies. Briefings in Functional Genomics. 19 (3), 191-200 (2020).
- Li, C., Mei, H., Hu, Y. Applications and explorations of CRISPR/Cas9 in CAR-T-cell therapy. Briefings in Functional Genomics. 19 (3), 175-182 (2020).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Jinek, M., et al. RNA-programmed genome editing in human cells. Elife. 2, 00471 (2013).
- Schluns, K. S., Kieper, W. C., Jameson, S. C., Lefrançois, L. Interleukin-7 mediates the homeostasis of naive and memory CD8 T cells in vivo. Nature Immunology. 1 (5), 426-432 (2000).
- Prlic, M., Lefrancois, L., Jameson, S. C. Multiple choices: regulation of memory CD8 T cell generation and homeostasis by interleukin (IL)-7 and IL-15. The Journal of Experimental Medicine. 195 (12), 49-52 (2002).
- Zhou, J., et al. Chimeric antigen receptor T (CAR-T) cells expanded with IL-7/IL-15 mediate superior antitumor effects. Protein & Cell. 10 (10), 764-769 (2019).
- Hultquist, J. F., et al. CRISPR-Cas9 genome engineering of primary CD4+ T cells for the interrogation of HIV-host factor interactions. Nature Protocols. 14 (1), 1-27 (2019).
- Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition. Nucleic Acids Research. 42 (22), 168 (2014).
