جيل وثقافة Organoids اللغوية المستمدة من الخلايا الجذعية طعم الماوس الكبار
Summary
يقدم البروتوكول طريقة لزراعة ومعالجة الأجهزة العضوية اللغوية المشتقة من الخلايا الجذعية المذاق المعزولة عن حليمة الذوق الخلفي للفئران البالغة.
Abstract
يتم التوسط في حاسة الذوق من قبل براعم الذوق على اللسان ، والتي تتكون من خلايا مستقبلات الذوق المتجددة بسرعة (TRCs). هذا الدوران المستمر مدعوم من خلايا السلف المحلية ويجعل وظيفة الذوق عرضة للاضطراب من قبل العديد من العلاجات الطبية ، والتي بدورها تؤثر بشدة على نوعية الحياة. وبالتالي، فإن دراسة هذه العملية في سياق العلاج من المخدرات أمر حيوي لفهم ما إذا كانت وظيفة سلف الذوق وإنتاج TRC تتأثر وكيفية ذلك. وبالنظر إلى المخاوف الأخلاقية والتوافر المحدود لأنسجة الذوق البشري ، فإن نماذج الماوس ، التي لديها نظام طعم مشابه للبشر ، تستخدم عادة. بالمقارنة مع أساليب الجسم الحي ، والتي تستغرق وقتا طويلا ومكلفة وغير قابلة للدراسات عالية الإنتاجية ، يمكن أن تمكن الأجهزة اللغوية المورين من تشغيل التجارب بسرعة مع العديد من التكرارات وعدد أقل من الفئران. هنا، تم تكييف البروتوكولات المنشورة سابقا ويتم تقديم طريقة موحدة لتوليد الأجهزة العضوية الذوق من خلايا السلف الذوق معزولة عن الحليمة المحيطة (CVP) من الفئران البالغة. خلايا السلف الذوق في CVP التعبير LGR5 ويمكن عزلها عن طريق EGFP تفلور تنشيط فرز الخلايا (FACS) من الفئران التي تحمل Lgr5EGFP-IRES-CreERT2 أليل. يتم صفيحة الخلايا المفرزة على نظام ثقافة ثلاثي الأبعاد قائم على هلام المصفوفة ومثقفة لمدة 12 يوما. الأجهزة العضوية توسيع لأول 6 أيام من فترة الثقافة عن طريق الانتشار ومن ثم الدخول في مرحلة التمايز، والتي تولد جميع أنواع الخلايا طعم ثلاثة جنبا إلى جنب مع الخلايا الظهارية غير الذوق. يمكن حصاد الأجهزة العضوية عند النضج في اليوم 12 أو في أي وقت أثناء عملية النمو للتعبير عن الحمض النووي الريبي والتحليل الكيميائي المناعي. توحيد أساليب الثقافة لإنتاج organoids لغوية من الخلايا الجذعية الكبار سوف يحسن استنساخ وتقدم organoids اللغوية كأداة قوية لفحص المخدرات في الكفاح من أجل مساعدة المرضى الذين يعانون من خلل الذوق.
Introduction
في القوارض ، يتم إيواء براعم الذوق اللغوي في حليمة فطرية موزعة بشكل مسبق ، حليمة مناجاة ثنائية الخلفي ، وكذلك حليمة محيطة واحدة (CVP) في خط الوسط الملصقات لللسان1. ويتكون كل برعم طعم من 50-100 قصيرة الأجل، وتجديد سريع خلايا مستقبلات الذوق (TRCs)، والتي تشمل نوع الأول مثل خلايا الدعم glial، نوع الخلايا الثانية التي تكشف الحلو، المر، وumami، والخلايا من النوع الثالث التي تكشف الحامض2،3،4. في CVP الماوس، LGR5+ الخلايا الجذعية على طول الصفيحة القاعدية تنتج جميع أنواع TRC وكذلك الخلايا الظهارية غير الذوق5. عند تجديد نسب الذوق ، يتم تحديد خلايا ابنة LGR5 لأول مرة كخلايا سلائف طعم ما بعد الميتوتيك (خلايا النوع الرابع) التي تدخل برعم الذوق وقادرة على التفريق في أي من أنواع TRCالثلاثة 6. دوران سريع من TRCs يجعل نظام الذوق عرضة للاضطراب من قبل العلاجات الطبية، بما في ذلك الإشعاع وبعض العلاجات الدوائية7،8،9،10،11،12،13. وبالتالي ، فإن دراسة نظام الذوق في سياق تنظيم الخلايا الجذعية الذوق والتمايز TRC أمر حيوي لفهم كيفية التخفيف من أو منع خلل الذوق.
الفئران هي نموذج تقليدي لدراسات الجسم الحي في علم الذوق حيث أن لديها نظام الذوق نظمت على نحو مماثل للبشر14،15،16. ومع ذلك ، فإن الفئران ليست مثالية لدراسات الإنتاجية العالية ، لأنها مكلفة للحفاظ عليها وتستغرق وقتا طويلا للعمل معها. للتغلب على ذلك، تم تطوير أساليب في المختبر زراعة الجهازية في السنوات الأخيرة. يمكن أن تولد الأجهزة العضوية الذوق من الأنسجة CVP الأصلية، وهي العملية التي الأجهزة برعم قبالة من ظهارة CVP الماوس معزولة مثقف ex vivo17. هذه organoids عرض ظهارة متعددة الطبقات تتفق مع نظام الذوق في الجسم الحي. تم تطوير طريقة أكثر كفاءة لتوليد organoids التي لا تتطلب ثقافة CVP الجسم الحي السابق من قبل رين وآخرون. تكييف أساليب والثقافة وسائل الإعلام وضعت لأول مرة لتنمو organoids المعوية، فإنها عزل Lgr5-GFP واحد+ خلايا السلف من CVP الماوس ومطلي لهم في هلام مصفوفة19. ولدت هذه الخلايا وحيدة organoids اللغوية التي تتكاثر خلال الأيام ال 6 الأولى من الثقافة، وتبدأ في التفريق حول اليوم 8، وبحلول نهاية فترة الثقافة تحتوي على خلايا الظهارية غير الذوق وجميع أنواع TRCالثلاثة 18،20. حتى الآن، وقد نشرت دراسات متعددة باستخدام نظام نموذج organoid لغوي17،18،20،21،22؛ ومع ذلك، تختلف الأساليب والظروف الثقافية المستخدمة لتوليد هذه الأجهزة العضوية عبر المنشورات(الجدول التكميلي 1). وهكذا، تم تعديل هذه الأساليب وتحسينها هنا لتقديم بروتوكول موحد مفصل لثقافة organoids اللغوية المستمدة من LGR5+ السلف من CVP الماوس الكبار.
توفر الأجهزة العضوية اللغوية نموذجا فريدا لدراسة العمليات البيولوجية للخلايا التي تقود تطور خلايا الذوق وتجديدها. مع توسع تطبيقات الأجهزة العضوية اللغوية والتحرك نحو استخدام المزيد من المختبرات في نماذج الجهازية المختبرية ، من المهم أن يسعى المجال إلى تطوير واعتماد بروتوكولات موحدة لتحسين القابلية للاستنساخ. إن إنشاء أعضاء لغوية كأداة قياسية في علم الذوق من شأنه أن يمكن دراسات الإنتاجية العالية التي تتباعد كيف تولد الخلايا الجذعية المفردة الخلايا المتمايزة لنظام ذوق البالغين. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام الأجهزة اللغوية لفحص الأدوية بسرعة للتأثيرات المحتملة على التوازن الذوقي ، والتي يمكن بعد ذلك التحقيق فيها بشكل أكثر شمولا في النماذج الحيوانية. وسيعزز هذا النهج في نهاية المطاف الجهود الرامية إلى ابتكار علاجات تحسن نوعية حياة متلقي الأدوية في المستقبل.
Protocol
Representative Results
Discussion
وذكرت هنا هو وسيلة فعالة وقابلة للتكرار بسهولة لزراعة وصيانة ومعالجة organoids اللغوية المستمدة من الخلايا الجذعية طعم الماوس الكبار. ووجد أن استخدام ثلاثة CVPs من 8 إلى 20 أسبوعا Lgr5–فئران EGFP كافية للحصول على ~ 10000 GFP+ الخلايا للاستخدام التجريبي ، مما أدى إلى 50 بئرا مطلية بكثافة 200 خلية لك…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
الكتاب أود أن أشكر الدكتور بيتر ديمبسي ومونيكا براون (جامعة كولورادو Anschutz الطبية الحرم الجامعي Organoid والأنسجة النمذجة الموارد المشتركة) لتوفير وسائل الإعلام WNR مشروطة ومناقشات قيمة. نشكر أيضا جامعة كولورادو تقنيات الخلايا مركز السرطان وتدفق الموارد المشتركة قياس الخلايا، وخاصة ديمتري باتورين، لخبرة فرز الخلايا. تم تمويل هذا العمل من قبل: NIH/NIDCD R01 DC012383، DC012383-S1، DC012383-S2، والمعاهد القومية للصحة/NCI R21 CA236480 إلى LAB، وR21DC016131 وR21DC016131-02S1 إلى DG، وF32 DC015958 إلى EJG.
Materials
| Antibodies | |||
| Alexa Fluor 546 Donkey anti Goat IgG | Molecular Probes | A11056, RRID: AB_142628 | 1:2000 |
| Alexa Fluor 546 Goat anti Rabbit IgG | Molecular Probes | A11010, RRID:AB_2534077 | 1:2000 |
| Alexa Fluor 568 Goat anti Guinea pig IgG | Invitrogen | A11075, RRID:AB_2534119 | 1:2000 |
| Alexa Fluor 647 Donkey anti Rabbit IgG | Molecular Probes | A31573, RRID:AB_2536183 | 1:2000 |
| Alexa Fluor 647 Goat anti Rat IgG | Molecular Probes | A21247, RRID:AB_141778 | 1:2000 |
| DAPI (for FACS) | Thermo Fischer | 62247 | |
| DAPI (for immunohistochemistry) | Invitrogen | D3571, RRID:AB_2307445 | 1:10000 |
| Goat anti-CAR4 | R&D Systems | AF2414, RRID:AB_2070332 | 1:50 |
| Guinea pig anti-KRT13 | Acris Antibodies | BP5076, RRID:AB_979608 | 1:250 |
| Rabbit anti-GUSTDUCIN | Santa Cruz Biotechnology Inc. | sc-395, RRID:AB_673678 | 1:250 |
| Rabbit anti-NTPDASE2 | CHUQ | mN2-36LI6, RRID:AB_2800455 | 1:300 |
| Rat anti-KRT8 | DSHB | TROMA-IS, RRID: AB_531826 | 1:100 |
| Equipment | |||
| 2D rocker | Benchmark Scientific Inc. | BR2000 | |
| 3D Rotator | Lab-Line Instruments | 4630 | |
| Big-Digit Timer/Stopwatch | Fisher Scientific | S407992 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5415D | |
| CO2 tank | Airgas | CD USP50 | |
| FormaTM Series 3 Water Jackeed CO2 Incubator | Thermo Scientific | 4110 | 184 L, Polished Stainless Steel |
| Incucyte | Sartorius | Model: S3 | Cancer Center Cell Technologies Shared Resource, University of Colorado Anschutz Medical Campus |
| MoFlo XDP100 | Cytomation Inc | Model: S13211997 | Gates Center Flow Cytometry Core, University of Colorado Anschutz Medical Campus |
| Orbital Shaker | New Brunswick Scientific | Excella E1 | |
| Real-Time PCR System | Applied Biosystems | 4376600 | |
| Refrigerated Centrifuge | Eppendorf | 5417R | |
| Spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-1000 | |
| Stereomicroscope | Zeiss | Stemi SV6 | |
| Thermal Cycler | Bio-Rad | 580BR | |
| Vortex | Fisher Scientific | 12-812 | |
| Water bath | Precision | 51220073 | |
| Media | |||
| A83 01 | Sigma | SML0788-5MG | Stock concentration 10 mM, final concentration 500 nM |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
| B27 Supplement | Gibco | 17504044 | Stock concentration 50X, final concentration 1X |
| Gentamicin | Gibco | 15750-060 | Stock concentration 1000X, final concentration 1X |
| Glutamax | Gibco | 35050061 | Stock concentration 100X, final concentration 1X |
| HEPES | Gibco | 15630080 | Stock concentration 100X, final concentration 1X |
| Murine EGF | Peprotech | 315-09-1MG | Stock concentration 500 µg/mL, final concentration 50 ng/mL |
| Murine Noggin | Peprotech | 250-38 | Stock concentration 50 µg/mL, final concentration 25 ng/mL |
| N-acetyl-L-cysteine | Sigma | A9165 | Stock concentration 0.5 M, final concentration 1 mM |
| Nicotinamide | Sigma | N0636-100g | Stock concentration 1 M, final concentration 1 mM |
| Pen/Strep | Gibco | 15140-122 | Stock concentration 100X, final concentration 1X |
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | Stock concentration 500X, final concentration 1X |
| SB202190 | R&D Systems | 1264 | Stock concentration 10 mM, final concentration 0.4 µM |
| WRN Conditioned media | Received from Dempsey Lab (AMC Organoid and Tissue Modeling Share Resource). Derived from L-WRN (ATCC® CRL-3276™) cells | ||
| Y27632 dihydochloride 10ug | APExBIO | A3008-10 | Stock concentration 10 mM, final concentration 10 µM |
| Outro | |||
| 1 ml TB Syringe | BD Syringe | 309659 | |
| 2-Mercaptoethanol, min. 98% | Sigma | M3148-25ML | β-mercaptoethanol |
| 2.0 mL Microcentrifuge Tubes | USA Scientific | 1420-2700 | |
| 48-well plates | Thermo Scientific | 150687 | |
| 5 3/4 inch Pasteur Pipets | Fisherbrand | 12-678-8A | |
| Albumin from bovine serum (BSA) | Sigma Life Science | A9647-100G | |
| Buffer RLT Lysis buffer | QIAGEN | 1015750 | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | |
| Cohan-Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-02 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum, type I | Sigma Life Science | C0130-1G | |
| Cultrex RGF BME, Type 2, Pathclear | R&D Systems | 3533-005-02 | Matrigel |
| Dispase II (neutral protease, grade II) | Sigma-Aldrich (Roche) | 4942078001 | |
| Disposable Filters | Sysmex | 04-0042-2316 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline pH 7.4 (1X) (Ca2+ & Mg2+ free) | Gibco | 10010-023 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline with Ca2+ & Mg2+ | Sigma Life Sciences | D8662-500ML | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | |
| EDTA, 0.5M (pH 8.0) | Promega | V4231 | |
| Elastase Lyophilized | Worthington Biochemical | LS002292 | |
| Extra Fine Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 26140-079 | |
| Fluoromount G | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| HEPES Solution | Sigma Life Science | H3537-100ML | |
| HyClone Tryspin 0.25% + EDTA | Thermo Scientific | 25200-056 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 1706691 | |
| Modeling Clay, Gray | Sargent Art | 22-4084 | |
| Needle | BD Syringe | 305106 | |
| Normal Donkey Serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| Normal Goat Serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| PowerSYBR Green PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4367659 | |
| RNeasy Micro Kit | QIAGEN | 74004 | |
| Safe-Lock Tubes 1.5 mL | Eppendorf | 022363204 | |
| Sodium Chloride | Fisher Chemical | 7647-14-5 | |
| Sodium Phosphate dibasic anhydrous | Fisher Chemical | 7558-79-4 | |
| Sodium Phosphate monobasic anhydrous | Fisher Bioreagents | 7558-80-7 | |
| SuperFrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Surgical Scissors – Sharp | Fine Science Tools | 14002-14 | |
| Triton X-100 | Sigma Life Science | T8787-100ML | |
| VWR micro cover glass | VWR | 48366067 | 22x22mm |
Referências
- Barlow, L. A. Progress and renewal in gustation: new insights into taste bud development. Development. 142, 3620-3629 (2015).
- Liman, E. R., Zhang, Y. V., Montell, C. Peripheral coding of taste. Neuron. 81 (5), 984-1000 (2014).
- Finger, T. E., Silver, W. L. . The neurobiology of taste and smell. , 287-314 (2000).
- Barlow, L. A., Klein, O. D. Developing and regenerating a sense of taste. Current Topics in Developmental Biology. 111, 401-419 (2015).
- Yee, K. K., et al. Lgr5-EGFP marks taste bud stem/progenitor cells in posterior tongue. Stem Cells. 31 (5), 992-1000 (2013).
- Miura, H., Scott, J. K., Harada, S., Barlow, L. A. Sonic hedgehog-expressing basal cells are general post-mitotic precursors of functional taste receptor cells. Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 243 (10), 1286-1297 (2014).
- Deshpande, T. S., et al. Radiation-related alterations of taste function in patients with head and neck cancer: a systematic review. Current Treatment Options in Oncology. 19 (12), 12 (2018).
- Nolden, A. A., Hwang, L. D., Boltong, A., Reed, D. R. Chemosensory changes from cancer treatment and their effects on patients’ food behavior: A scoping review. Nutrients. 11 (10), 2285 (2019).
- Doty, R. L., Shah, M., Bromley, S. M. Drug-induced taste disorders. Drug Safety. 31 (3), 199-215 (2008).
- Kumari, A., et al. Recovery of taste organs and sensory function after severe loss from Hedgehog/Smoothened inhibition with cancer drug sonidegib. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (48), 10369-10378 (2017).
- Ermilov, A. N., et al. Maintenance of taste organs is strictly dependent on epithelial hedgehog/gli signaling. PLoS Genetics. 12 (11), 1006442 (2016).
- Gaillard, D., Shechtman, L. A., Millar, S. E., Barlow, L. A. Fractionated head and neck irradiation impacts taste progenitors, differentiated taste cells, and Wnt/β-catenin signaling in adult mice. Scientific Reports. 9, 17934 (2019).
- Nguyen, H. M., Reyland, M. E., Barlow, L. A. Mechanisms of taste bud cell loss after head and neck irradiation. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 32 (10), 3474-3484 (2012).
- Ohla, K., et al. Recognizing taste: Coding patterns along the neural axis in mammals. Chemical Senses. 44 (4), 237-247 (2019).
- Chaudhari, N., Roper, S. D. The cell biology of taste. The Journal of Cell Biology. 190, 285-296 (2010).
- Breslin, P. A., Spector, A. C. Mammalian taste perception. Current Biology: CB. 18 (4), 148-155 (2008).
- Aihara, E., et al. Characterization of stem/progenitor cell cycle using murine circumvallate papilla taste bud organoid. Scientific Reports. 5, 17185 (2015).
- Ren, W., et al. Single Lgr5- or Lgr6-expressing taste stem/progenitor cells generate taste bud cells ex vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (46), 16401-16406 (2014).
- Sato, T., Clevers, H. Primary mouse small intestinal epithelial cell cultures. Methods in Molecular Biology. 945, 319-328 (2013).
- Ren, W., et al. Transcriptome analyses of taste organoids reveal multiple pathways involved in taste cell generation. Scientific Reports. 7, 4004 (2017).
- Feng, S., Achoute, L., Margolskee, R. F., Jiang, P., Wang, H. Lipopolysaccharide-induced inflammatory cytokine expression in taste organoids. Chemical Senses. 45 (3), 187-194 (2020).
- Lin, X., et al. R-spondin substitutes for neuronal input for taste cell regeneration in adult mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (2), 2001833118 (2021).
- Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture. Nature Protocols. 8 (12), 2471-2482 (2013).
- Staats, J., Divekar, A., McCoy, J. P., Maecker, H. T. . Immunophenotyping: Methods and Protocols. , 81-104 (2019).
- Perfetto, S. P., et al. Amine-reactive dyes for dead cell discrimination in fixed samples. Current Protocols in Cytometry. , (2010).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett’s epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Morizane, R., Bonventre, J. V. Generation of nephron progenitor cells and kidney organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 12 (1), 195-207 (2017).
- Ekert, J. E., et al. Recommended guidelines for developing, qualifying, and implementing complex in vitro models (CIVMs) for drug discovery. SLAS Discovery: Advancing Life Sciences R & D. 25 (10), 1174-1190 (2020).
- Dekkers, J. F., et al. High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids. Nature Protocols. 14 (6), 1756-1771 (2019).
- Fujii, M., et al. Human intestinal organoids maintain self-renewal capacity and cellular diversity in niche-inspired culture condition. Cell Stem Cell. 23 (6), 787-793 (2018).
- Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Castillo-Azofeifa, D., et al. Sonic hedgehog from both nerves and epithelium is a key trophic factor for taste bud maintenance. Development. 144 (17), 3054-3065 (2017).
- Vintschgau, M. v., Hönigschmied, J. Nervus glossopharyngeus und schmeckbecher. Archiv für die gesamte Physiologie des Menschen und der Tiere. 14, 443-448 (1877).
- Liu, H. X., et al. Multiple Shh signaling centers participate in fungiform papilla and taste bud formation and maintenance. Biologia do Desenvolvimento. 382 (1), 82-97 (2013).
- Workman, M. J., et al. Engineered human pluripotent-stem-cell-derived intestinal tissues with a functional enteric nervous system. Nature Medicine. 23 (1), 49-59 (2017).
- Koning, M., vanden Berg, C. W., Rabelink, T. J. Stem cell-derived kidney organoids: engineering the vasculature. Cell and Molecular Life Sciences: CMLS. 77 (12), 2257-2273 (2020).
