成人マウス味幹細胞由来の舌下オルガノイドの生成と培養
Summary
このプロトコルは、成体マウスの後味乳頭から単離された味覚幹細胞に由来する言語オルガノイドを培養および処理するための方法を提示する。
Abstract
味覚は舌の味覚芽によって媒介され、急速に更新される味覚受容体細胞(TRC)で構成されています。この継続的な売上高は、局所的な前駆細胞によって動力を与えられ、多数の医療によって混乱を招きやすい味覚機能を提供し、生活の質に深刻な影響を与えます。したがって、薬物治療の文脈でこのプロセスを研究することは、味前駆物質機能とTRC産生が影響を受けるかどうか、そしてどのように影響を受けるかを理解するために不可欠です。倫理的な懸念と人間の味の組織の限られた可用性を考えると、マウスモデルは、人間と同様の味覚システムを持つ、一般的に使用されています。時間がかかり、高価で、高スループットの研究に適していない in vivo 方法と比較して、マウスリングアルガノイドは、多くの複製と少ないマウスで実験を迅速に実行することができます。ここで、以前に公開されたプロトコルが適応され、成体マウスの周回乳頭(CVP)から分離された味覚前駆細胞からオルガノイドの味覚を生成するための標準化された方法が提示されている。CVP発現LGR5中の前駆細胞を味わい、Lgr5EGFP-IRES-CreERT2 アレルを運ぶマウスからEGFP蛍光活性化細胞選別(FACS)を介して単離することができる。並べ替えられた細胞は、マトリックスゲルベースの3D培養システムにメッキされ、12日間培養されます。オルガノイドは、増殖を介して培養期間の最初の6日間増殖し、その間に非味上皮細胞と共に3つの味細胞タイプすべてを生成する分化段階に入る。オルガノイドは、12日目の成熟時、またはRNA発現および免疫組織化学分析のための成長過程でいつでも収穫することができる。成体幹細胞から言語性オルガノイドを生産するための培養方法を標準化することは、味覚機能障害を経験している患者を助けるために戦いの強力な薬物スクリーニングツールとして再現性を向上させ、言語オルガノイドを進めます。
Introduction
げっ歯類では、舌の後臭中線で舌の舌の前に分布する乳頭の真菌、両側葉乳頭、ならびに単一の周回乳頭(CVP)に舌の味覚芽が収容される。各味覚芽は、50〜100の短命で急速に更新される味覚受容体細胞(TRC)で構成され、I型グリア様支持細胞、甘味、苦い、旨味を検出するII型細胞、酸味2、3、4を検出するIII型細胞が含まれる。マウスCVPにおいて、基底層に沿ったLGR5+幹細胞は、非味の上皮細胞と同様に、すべてのTRCタイプを産生する5。味覚系統を更新する場合、LGR5娘細胞は、味覚芽に入り、3つのTRCタイプ6のいずれかに分化することができる、まず、味覚後前駆細胞(IV型細胞)として指定される。TRCの急速な回転は、放射線および特定の薬物療法を含む治療によって中断されやすい味覚システムをレンダリングします7,8,9,10 ,11,12,13.したがって、味覚機能の制御とTRC分化のコンテキストで味覚システムを研究することは、味覚機能障害を軽減または予防する方法を理解するために不可欠である。
マウスは、ヒト14、15、16と同様に組織された味覚システムを有するため、味覚科学におけるインビボ研究の伝統的なモデルである。しかし、マウスは維持コストが高く、作業に時間がかかるため、高スループット研究には適していません。これを克服するために、インビトロオルガノイド培養方法が近年開発されている。味オルガノイドは、天然のCVP組織から生成することができ、単離マウスCVP上皮培養ex vivo17からオルガノイドが芽を出すプロセスである。これらのオルガノイドは、インビボ味覚システムと一致する多層上皮を示す。ex vivo CVP培養を必要としないオルガノイドを生成するより効率的な方法は、2014年18年にRenらによって開発されました。腸オルガノイドを成長させるために最初に開発された方法および培養培地を適応させ、マウスCVPから単一のLgr5-GFP+前駆細胞を単離し、マトリックスゲル19にめっきした。培養の最初の6日間に増殖するこれらの単一細胞は、8日目頃に分化し始め、培養期間の終わりまでに非味覚上皮細胞および3種類のTRCタイプ18、20すべてを含む。現在までに、言語オルガノイドモデルシステムを利用した複数の研究が17、18、20、21、22に掲載されています。しかしながら、これらのオルガノイドを生成するために使用される方法と培養条件は、出版物によって異なる(補足表1)。したがって、これらの方法は、ここで調整され、成人マウスCVPのLGR5+前駆体に由来する言語オルガノイドの培養のための詳細な標準化されたプロトコルを提示するように最適化されている。
言語オルガノイドは、味細胞の発達と再生を駆動する細胞生物学的プロセスを研究するためのユニークなモデルを提供します。イン ビトロ オルガノイドモデルの活用に向けて、言語オルガノイドの応用が拡大し、ラボが増える中、再現性を高めるために標準化されたプロトコルの開発と採用に取り組む分野が重要です。味覚科学の中で標準的なツールとして言語オルガノイドを確立することは、単一の幹細胞が成体味システムの分化された細胞を生成する方法を引き離す高スループット研究を可能にする。さらに、舌間オルガノイドは、味の恒常性に影響を与える可能性のある薬物を迅速にスクリーニングするために使用することができ、動物モデルでより徹底的に調査することができます。このアプローチは、最終的には、将来の薬物レシピエントの生活の質を向上させる治療法を考案するための努力を強化します。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここで報告されているのは、成人マウス味覚幹細胞に由来する言語オルガノイドを培養、維持、処理するための効率的かつ容易に再現可能な方法である。8〜20週齢のLgr5-EGFPマウスの3つのCvPsを使用すると、実験用に約10,000 GFP+細胞を得るのに十分であり、その結果、48ウェルプレートのウェルあたり200細胞の密度で50のウェルがメッキされることがわかりました。CVPトレンチ上皮…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、WNR条件付きメディアと貴重な議論を提供してくれたピーター・デンプシー博士とモニカ・ブラウン(コロラド大学アンシュッツ医療キャンパスオルガノイドと組織モデリング共有リソース)に感謝したいと考えています。また、コロラド大学がんセンターの細胞技術とフローサイトメトリー共有リソース、特にドミトリー・バトゥリンの細胞選別の専門知識に感謝します。この作品は、次の資金を提供しました: NIH/NIDCD R01 DC012383, DC012383-S1、DC012383-S2、NIH/NCI R21 CA236480からLABへ、R21DC016131およびR21DC016131-02S1からDG、およびF32 DC015958からEJGへ。
Materials
| Antibodies | |||
| Alexa Fluor 546 Donkey anti Goat IgG | Molecular Probes | A11056, RRID: AB_142628 | 1:2000 |
| Alexa Fluor 546 Goat anti Rabbit IgG | Molecular Probes | A11010, RRID:AB_2534077 | 1:2000 |
| Alexa Fluor 568 Goat anti Guinea pig IgG | Invitrogen | A11075, RRID:AB_2534119 | 1:2000 |
| Alexa Fluor 647 Donkey anti Rabbit IgG | Molecular Probes | A31573, RRID:AB_2536183 | 1:2000 |
| Alexa Fluor 647 Goat anti Rat IgG | Molecular Probes | A21247, RRID:AB_141778 | 1:2000 |
| DAPI (for FACS) | Thermo Fischer | 62247 | |
| DAPI (for immunohistochemistry) | Invitrogen | D3571, RRID:AB_2307445 | 1:10000 |
| Goat anti-CAR4 | R&D Systems | AF2414, RRID:AB_2070332 | 1:50 |
| Guinea pig anti-KRT13 | Acris Antibodies | BP5076, RRID:AB_979608 | 1:250 |
| Rabbit anti-GUSTDUCIN | Santa Cruz Biotechnology Inc. | sc-395, RRID:AB_673678 | 1:250 |
| Rabbit anti-NTPDASE2 | CHUQ | mN2-36LI6, RRID:AB_2800455 | 1:300 |
| Rat anti-KRT8 | DSHB | TROMA-IS, RRID: AB_531826 | 1:100 |
| Equipment | |||
| 2D rocker | Benchmark Scientific Inc. | BR2000 | |
| 3D Rotator | Lab-Line Instruments | 4630 | |
| Big-Digit Timer/Stopwatch | Fisher Scientific | S407992 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5415D | |
| CO2 tank | Airgas | CD USP50 | |
| FormaTM Series 3 Water Jackeed CO2 Incubator | Thermo Scientific | 4110 | 184 L, Polished Stainless Steel |
| Incucyte | Sartorius | Model: S3 | Cancer Center Cell Technologies Shared Resource, University of Colorado Anschutz Medical Campus |
| MoFlo XDP100 | Cytomation Inc | Model: S13211997 | Gates Center Flow Cytometry Core, University of Colorado Anschutz Medical Campus |
| Orbital Shaker | New Brunswick Scientific | Excella E1 | |
| Real-Time PCR System | Applied Biosystems | 4376600 | |
| Refrigerated Centrifuge | Eppendorf | 5417R | |
| Spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-1000 | |
| Stereomicroscope | Zeiss | Stemi SV6 | |
| Thermal Cycler | Bio-Rad | 580BR | |
| Vortex | Fisher Scientific | 12-812 | |
| Water bath | Precision | 51220073 | |
| Media | |||
| A83 01 | Sigma | SML0788-5MG | Stock concentration 10 mM, final concentration 500 nM |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
| B27 Supplement | Gibco | 17504044 | Stock concentration 50X, final concentration 1X |
| Gentamicin | Gibco | 15750-060 | Stock concentration 1000X, final concentration 1X |
| Glutamax | Gibco | 35050061 | Stock concentration 100X, final concentration 1X |
| HEPES | Gibco | 15630080 | Stock concentration 100X, final concentration 1X |
| Murine EGF | Peprotech | 315-09-1MG | Stock concentration 500 µg/mL, final concentration 50 ng/mL |
| Murine Noggin | Peprotech | 250-38 | Stock concentration 50 µg/mL, final concentration 25 ng/mL |
| N-acetyl-L-cysteine | Sigma | A9165 | Stock concentration 0.5 M, final concentration 1 mM |
| Nicotinamide | Sigma | N0636-100g | Stock concentration 1 M, final concentration 1 mM |
| Pen/Strep | Gibco | 15140-122 | Stock concentration 100X, final concentration 1X |
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | Stock concentration 500X, final concentration 1X |
| SB202190 | R&D Systems | 1264 | Stock concentration 10 mM, final concentration 0.4 µM |
| WRN Conditioned media | Received from Dempsey Lab (AMC Organoid and Tissue Modeling Share Resource). Derived from L-WRN (ATCC® CRL-3276™) cells | ||
| Y27632 dihydochloride 10ug | APExBIO | A3008-10 | Stock concentration 10 mM, final concentration 10 µM |
| Outro | |||
| 1 ml TB Syringe | BD Syringe | 309659 | |
| 2-Mercaptoethanol, min. 98% | Sigma | M3148-25ML | β-mercaptoethanol |
| 2.0 mL Microcentrifuge Tubes | USA Scientific | 1420-2700 | |
| 48-well plates | Thermo Scientific | 150687 | |
| 5 3/4 inch Pasteur Pipets | Fisherbrand | 12-678-8A | |
| Albumin from bovine serum (BSA) | Sigma Life Science | A9647-100G | |
| Buffer RLT Lysis buffer | QIAGEN | 1015750 | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | |
| Cohan-Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-02 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum, type I | Sigma Life Science | C0130-1G | |
| Cultrex RGF BME, Type 2, Pathclear | R&D Systems | 3533-005-02 | Matrigel |
| Dispase II (neutral protease, grade II) | Sigma-Aldrich (Roche) | 4942078001 | |
| Disposable Filters | Sysmex | 04-0042-2316 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline pH 7.4 (1X) (Ca2+ & Mg2+ free) | Gibco | 10010-023 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline with Ca2+ & Mg2+ | Sigma Life Sciences | D8662-500ML | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | |
| EDTA, 0.5M (pH 8.0) | Promega | V4231 | |
| Elastase Lyophilized | Worthington Biochemical | LS002292 | |
| Extra Fine Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 26140-079 | |
| Fluoromount G | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| HEPES Solution | Sigma Life Science | H3537-100ML | |
| HyClone Tryspin 0.25% + EDTA | Thermo Scientific | 25200-056 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 1706691 | |
| Modeling Clay, Gray | Sargent Art | 22-4084 | |
| Needle | BD Syringe | 305106 | |
| Normal Donkey Serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| Normal Goat Serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| PowerSYBR Green PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4367659 | |
| RNeasy Micro Kit | QIAGEN | 74004 | |
| Safe-Lock Tubes 1.5 mL | Eppendorf | 022363204 | |
| Sodium Chloride | Fisher Chemical | 7647-14-5 | |
| Sodium Phosphate dibasic anhydrous | Fisher Chemical | 7558-79-4 | |
| Sodium Phosphate monobasic anhydrous | Fisher Bioreagents | 7558-80-7 | |
| SuperFrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Surgical Scissors – Sharp | Fine Science Tools | 14002-14 | |
| Triton X-100 | Sigma Life Science | T8787-100ML | |
| VWR micro cover glass | VWR | 48366067 | 22x22mm |
Referências
- Barlow, L. A. Progress and renewal in gustation: new insights into taste bud development. Development. 142, 3620-3629 (2015).
- Liman, E. R., Zhang, Y. V., Montell, C. Peripheral coding of taste. Neuron. 81 (5), 984-1000 (2014).
- Finger, T. E., Silver, W. L. . The neurobiology of taste and smell. , 287-314 (2000).
- Barlow, L. A., Klein, O. D. Developing and regenerating a sense of taste. Current Topics in Developmental Biology. 111, 401-419 (2015).
- Yee, K. K., et al. Lgr5-EGFP marks taste bud stem/progenitor cells in posterior tongue. Stem Cells. 31 (5), 992-1000 (2013).
- Miura, H., Scott, J. K., Harada, S., Barlow, L. A. Sonic hedgehog-expressing basal cells are general post-mitotic precursors of functional taste receptor cells. Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 243 (10), 1286-1297 (2014).
- Deshpande, T. S., et al. Radiation-related alterations of taste function in patients with head and neck cancer: a systematic review. Current Treatment Options in Oncology. 19 (12), 12 (2018).
- Nolden, A. A., Hwang, L. D., Boltong, A., Reed, D. R. Chemosensory changes from cancer treatment and their effects on patients’ food behavior: A scoping review. Nutrients. 11 (10), 2285 (2019).
- Doty, R. L., Shah, M., Bromley, S. M. Drug-induced taste disorders. Drug Safety. 31 (3), 199-215 (2008).
- Kumari, A., et al. Recovery of taste organs and sensory function after severe loss from Hedgehog/Smoothened inhibition with cancer drug sonidegib. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (48), 10369-10378 (2017).
- Ermilov, A. N., et al. Maintenance of taste organs is strictly dependent on epithelial hedgehog/gli signaling. PLoS Genetics. 12 (11), 1006442 (2016).
- Gaillard, D., Shechtman, L. A., Millar, S. E., Barlow, L. A. Fractionated head and neck irradiation impacts taste progenitors, differentiated taste cells, and Wnt/β-catenin signaling in adult mice. Scientific Reports. 9, 17934 (2019).
- Nguyen, H. M., Reyland, M. E., Barlow, L. A. Mechanisms of taste bud cell loss after head and neck irradiation. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 32 (10), 3474-3484 (2012).
- Ohla, K., et al. Recognizing taste: Coding patterns along the neural axis in mammals. Chemical Senses. 44 (4), 237-247 (2019).
- Chaudhari, N., Roper, S. D. The cell biology of taste. The Journal of Cell Biology. 190, 285-296 (2010).
- Breslin, P. A., Spector, A. C. Mammalian taste perception. Current Biology: CB. 18 (4), 148-155 (2008).
- Aihara, E., et al. Characterization of stem/progenitor cell cycle using murine circumvallate papilla taste bud organoid. Scientific Reports. 5, 17185 (2015).
- Ren, W., et al. Single Lgr5- or Lgr6-expressing taste stem/progenitor cells generate taste bud cells ex vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (46), 16401-16406 (2014).
- Sato, T., Clevers, H. Primary mouse small intestinal epithelial cell cultures. Methods in Molecular Biology. 945, 319-328 (2013).
- Ren, W., et al. Transcriptome analyses of taste organoids reveal multiple pathways involved in taste cell generation. Scientific Reports. 7, 4004 (2017).
- Feng, S., Achoute, L., Margolskee, R. F., Jiang, P., Wang, H. Lipopolysaccharide-induced inflammatory cytokine expression in taste organoids. Chemical Senses. 45 (3), 187-194 (2020).
- Lin, X., et al. R-spondin substitutes for neuronal input for taste cell regeneration in adult mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (2), 2001833118 (2021).
- Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture. Nature Protocols. 8 (12), 2471-2482 (2013).
- Staats, J., Divekar, A., McCoy, J. P., Maecker, H. T. . Immunophenotyping: Methods and Protocols. , 81-104 (2019).
- Perfetto, S. P., et al. Amine-reactive dyes for dead cell discrimination in fixed samples. Current Protocols in Cytometry. , (2010).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett’s epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Morizane, R., Bonventre, J. V. Generation of nephron progenitor cells and kidney organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 12 (1), 195-207 (2017).
- Ekert, J. E., et al. Recommended guidelines for developing, qualifying, and implementing complex in vitro models (CIVMs) for drug discovery. SLAS Discovery: Advancing Life Sciences R & D. 25 (10), 1174-1190 (2020).
- Dekkers, J. F., et al. High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids. Nature Protocols. 14 (6), 1756-1771 (2019).
- Fujii, M., et al. Human intestinal organoids maintain self-renewal capacity and cellular diversity in niche-inspired culture condition. Cell Stem Cell. 23 (6), 787-793 (2018).
- Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Castillo-Azofeifa, D., et al. Sonic hedgehog from both nerves and epithelium is a key trophic factor for taste bud maintenance. Development. 144 (17), 3054-3065 (2017).
- Vintschgau, M. v., Hönigschmied, J. Nervus glossopharyngeus und schmeckbecher. Archiv für die gesamte Physiologie des Menschen und der Tiere. 14, 443-448 (1877).
- Liu, H. X., et al. Multiple Shh signaling centers participate in fungiform papilla and taste bud formation and maintenance. Biologia do Desenvolvimento. 382 (1), 82-97 (2013).
- Workman, M. J., et al. Engineered human pluripotent-stem-cell-derived intestinal tissues with a functional enteric nervous system. Nature Medicine. 23 (1), 49-59 (2017).
- Koning, M., vanden Berg, C. W., Rabelink, T. J. Stem cell-derived kidney organoids: engineering the vasculature. Cell and Molecular Life Sciences: CMLS. 77 (12), 2257-2273 (2020).
