Förhållandet mellan signal och brus av data är en av de viktigaste övervägandena vid röntgendiffraktionsmätningar från mikrokritik. VMXm-strållinjen ger en miljö med låg ljudnivå och mikrobeam för sådana experiment. Här beskriver vi provberedningsmetoder för montering och kylning av mikrokristaller för VMXm och andra makromolekylära kristallografistrålar med mikrofokus.
Monteringen av mikrokristaller (<10 μm) för enkelkristallkristallografi utgör en icke-trivial utmaning. Förbättringar av datakvaliteten har setts för mikrokristaler med utveckling av beamlineoptik, strålstabilitet och variabel strålstorlek med fokus från submicron till mikron, till exempel vid VMXm-strållinjen vid Diamond Light Source1. Ytterligare förbättringar av datakvaliteten kommer att uppnås genom förbättringar i urvalsmiljön och provberedning. Mikrokristaler genererar i sig svagare diffraktion, vilket förbättrar signal-till-bruset är nyckeln till att samla in röntgendiffraktionsdata av hög kvalitet och kommer främst från minskningar av bakgrundsljud. Viktiga källor till röntgenbakgrundsljud i ett diffraktionsexperiment kommer från deras interaktion med luftvägen före och efter provet, överskott av kristalliseringslösning som omger provet, närvaron av kristallin is och spridning från andra strållinjeinstrumenterings- eller röntgenfönster. VMXm-strållinjen består av instrumentering och ett provberedningsprotokoll för att minska alla dessa bullerkällor.
För det första tar en vakuumprovmiljö vid VMXm bort luftvägen mellan röntgenkälla och prov. Därefter använder provberedningsprotokoll för makromolekylär kristallografi vid VMXm ett antal processer och verktyg anpassade från cryoTEM. Dessa inkluderar kopparnät med håliga kolstödsfilmer, automatiserad blotting och avsvalkningsrobotik som använder flytande etan. Dessa verktyg möjliggör beredning av hundratals mikrokristaler på ett enda cryoTEM-nät med minimal omgivande vätska på ett lågbrusstöd. De minimerar också bildandet av kristallin is från eventuell återstående vätska som omger kristallerna.
Vi presenterar processen för att förbereda och bedöma kvaliteten på lösliga proteinmikrrystals med synligt ljus och skanna elektronmikroskopi innan du monterar proverna på VMXm-strållinjen för röntgendiffraktionsexperiment. Vi kommer också att ge exempel på prover av god kvalitet samt de som kräver ytterligare optimering och strategier för att göra det.
En viktig barriär för bestämning av högupplösta strukturer av biologiska molekyler genom makromolekylär kristallografi (MX) förblir produktionen av väl diffracting kristaller i en mottaglig storlek. Det finns många strategier för att uppnå detta mål från rekombinant protein gen konstruktion design till stora gles matris sökningar efter kemiska cocktails som kan generera initiala kristaller2. För den senare är det ofta så att kristallografen måste optimera eventuella initiala träffar för att erhålla kristaller med tillräcklig diffraktionskvalitet och storlek för strukturbestämningstudier3. Trots dessa alternativ kan vissa målmolekyler aldrig generera stora (>10 μm), väl diffracting kristaller och som ett resultat kristallografen måste framhärda med sina mikrokristaller och de utmaningar som sådana prover utgör. Dessa inkluderar lämpligt montering och kryoskyddande kristaller, hantering av i sig svagare diffraktion och ökad strålningskänslighet. Mikrokristaller bildas av färre enhetsceller och molekyler än större kristaller och som sådan förstärks diffraktionen inte i samma utsträckning jämfört med större kristaller, vilket resulterar i i sig svagare diffraktionsintensiteter. Det är viktigt att bakgrundssignalen inte maskerar dessa reflektioner, särskilt vid högre upplösning där svaga reflektionsintensiteter kan gå förlorade4. Dessutom är mikrokristaller känsligare för strålningsskador och trots att de registrerar diffraktion vidflytande kvävetemperaturer 5,kanske det inte är möjligt att samla in fullständiga data från en enda kristall, vilket gör det nödvändigt att samla in data från ett mycket stort antal kristaller för att producera en enda fullständig datauppsättning6.
Den ökande tillgången på röntgenfria elektronlasrar (XFELs) och utvecklingen av seriella kristallografimetoder (SFX)7 har gett vägar till insamling av data från mindre mikrokristaller. Dessa är dock skräddarsydda provleveransmetoder, som kräver en betydande mängd expertis inom hårdvara och programvara, där experimenten är begränsade till rumstemperatur och vanligtvis provförbrukningen är hög (hundratals mikroliter) och fortfarande kan kräva ytterligareoptimering 8. Projekt där endast en begränsad mängd mikrokribering kan göras är därför inte lämpliga för SFX.
Under tiden har synkrotronstrålelinjeteknik under de senaste decennierna utvecklats för att producera mindre, stabilarebalkar 9 med en briljans som har tillåtit datainsamling från allt mindrekristaller 10,11. Mikrofokusbalklinjer som FMX vid NSLS-II och I24 vid Diamond Light Source har kunnat bestämma nya strukturer från kristaller med maximala dimensioner på ~ 3 μm12 och visa förmågan att samla in användbara data från ännu mindre kristaller som mäter ~ 1 μm13. Strållinjen måste vara exakt konfigurerad, med utmärkt, högupplöst optik på axeln, en minimal förvirringssfär för provrotation och en exakt just justerad rotationsaxel som sammanfaller med röntgenstrålen. Det är viktigt att nära matcha röntgenstråleprofilen med kristallvolymen och se till att kristallen är exakt i linje med röntgenstrålen – en utmaning för kristaller <5 μm14. Att uppfylla dessa experimentella förhållanden vid strållinjen är avgörande för att registrera data av bästa kvalitet från mikrokritik.
Den återstående och kanske viktigaste aspekten av datainsamling från mikrokristaller är presentationen av kristallen till röntgenstrålen. Mikrokriber har ofta monterats på mikromeshprovfästen, tillverkade av polyimid, ett lågt röntgenspridningsmaterial med bländare så små som 10 μm15,16. Polyimidnätet är monterat på en standardstift som är inställt i en magnetisk SPINE-bas, vilket gör den kompatibel med de flesta MX-balklinjer17. Nätfästet används för att fiska kristaller från kristalliseringsdroppe ofta enligt samma förfarande som att montera en 100 μm kristall med ett standardslingformatfäste. Kristallerna kan fördelas över nätet, men en viktig nackdel är att en relativt stor mängd vätska kan bäras av nätet och stiftet under skörden (figur 1C,D). Denna vätskevolym, som kan vara många gånger större än kristallerna själva, kommer att bidra till bakgrundsljud när den belyses med röntgenstrålar. Denna bakgrundsspridning kan vara ännu starkare om vätskan bildar kristallin is under blixtkylning, vilket minskar signal-till-brusförhållandet för redan svaga intensiteter inom upplösningarna av isdiffraktion. Därför är det viktigt att överskott av vätska avlägsnas från provet för att säkerställa att alla möjliga signaler kan registreras. Denna utmaning är ännu större när det gäller membranproteinkristaller som bildas inom lipidkubikfasen (LCP), där LCP genererar stark bakgrundsspridning och är också svår att ta bort från runt kristallerna 18.
Den nya vmxm-strållinjen (Versatile Macromolecular Crystallography Micro Focus) vid Diamond Light Source ger förutsättningar för att samla in data från kristaller som potentiellt mäter mindre än en mikron i storlek. Strållinjen har utformats för att leverera en strålprofil som mäter 0,3 μm x 0,5 μm (VxH)1, en goniometer med en förvirringssfär som inte är större än 60 nm och en i vacuo-provmiljö. Dessa designfunktioner i VMXm-ändstationen minimerar genereringen av bakgrundsröntgenbuller av strålringsapparaten under datainsamlingen med den största återstående bakgrundskällan som genereras avprovet 14.
Specifika metoder för provberedning som är utformade för VMXm-strållinjen ger möjlighet att minska denna bakgrund och ytterligare förbättra signal-till-bruset för diffraktionsdata, vilket maximerar kvaliteten på de data som kan registreras från mikrokritertaler som mäter <10 μm. Många av de krav som beskrivs här för låg bakgrundsdiffraktion från mikrokritertaler är också vanliga för kryogen transmissionselektronmikroskopi (cryoTEM)19 och mikrokritrokristal elektrondiffraktion (microED)20. Som ett resultat är många av de verktyg som redan har utvecklats för beredning av cryoTEM-prover lämpliga, med vissa anpassningar, för beredning av mikrokristaler. Vid beredning av prover för enstaka partikel cryoTEM är de partiklar som under utredning är inbäddade i mycket tunna skikt (vanligtvis <100 nm) av glaskroppsis så att elektroner kan överföra genom provet. Det tunna enhetliga skiktet uppnås genom att blotta bort överflödig vätska och vitrifiering av provet uppnås genom snabb kylning av provet (~ 104 K s-1)21 genom att kasta i flytande etan som hålls på ~ 93 K22. Däremot är flytande kväve, som används rutinmässigt för MX-provberedning, en mindre effektiv kryogen än etan och har en större benägenhet för kristallin isbildning iprovet 21. Bildandet av kristallin is, som kan bryta ner diffraktion och generera bakgrundsljud, mildras normalt genom användning av kryoskyddande föreningar23. Polymerer med låg molekylvikt som polyetylenglykol (PEG) 400 och metyl-2,4-pentanediol (MPD), sockerarter, oljor eller mättade salter kan tillsättas till en alikvot av kristalliseringslösning i låga koncentrationer24– det finns inte en “one size fits all”-lösning för att välja det lämpligaste kryoprotektmedlet och detta kräver oftaoptimering 25 . Kristallen genomgår också flera manipuleringar under skörde- och kryoskyddsprocessen som kan leda till skador på kristallen, möjligheten att använda flytande etan gör det möjligt att utelämna detta steg och hjälper till att skydda kristallens integritet.
Medan flytande etan är en effektiv kryogen för mikrokristaller (<10 μm) på grund av provets tunnhet, finns det alternativa metoder för att förhindra kristallin isbildning, särskilt i större kristaller, inklusive att minska vattenhalten i kristallen genom användning av en hårt kontrollerad fuktig miljö26, eller genom att transportera överskott av vätska bort från både kristallens slinga och yta27 , kräver dessa dock återigen större manipulering av provet. Användningen av automatiserad blotting och doppfrysning med flytande etan, som i cryoTEM, tar tillsammans bort överskott av kristalliseringslösning och ger ett sätt att blinka coola mikrokristaller på ett kontrollerat sätt samtidigt som man försöker minimera manipulering.
Här presenterar vi ett protokoll som kan användas inte bara av användare av VMXm-strållinjen och vid andra mikrofokusbalklinjer för att samla in hög signal-till-brusdiffraktionsdata utan kan också vara användbara för dem som förbereder lösliga proteinkristall- och tvättmedelsbaserade membranproteinkristallprover för mikroED-experiment. Medan alla anläggningar för att förbereda och bedöma prover finns tillgängliga på VMXm, är många strukturbiologiska laboratorier alltmer utrustade för cryoTEM-provberedning. Som ett resultat av detta planerar vi att vissa användare kanske vill använda sina egna anläggningar för att förbereda sina prover för stråltid på VMXm.
Detta protokoll visar hur verktyg från cryoTEM provberedning kan användas för beredning av mikrokristaler för röntgendiffraktionsexperiment vid mikrofokusbalklinjer. Standardinstrumenteringen av strållinor är centrerad kring ett stiftmonterat prov och även om ansträngningar har gjorts för att ge ett provstöd på dessa fästen för mikrokriter, är de ofta utmanande att ladda med prov samtidigt som de säkerställer att högsta signal-till-brus uppnås(figur 1C,D). Många av dessa prover kan också kräva optimering av kryoskyddsförhållandena för att säkerställa att provet är glaskroppsbart. Frysningsmetoden ger ett repeterbart sätt att avlägsna överflödig vätska och blixtkyla provet i en effektiv kryogen(figur 1A,B). Medan gallret sedan kan monteras på en standardbalklinje med en pinmontering baserad på pin, har VMXm provhållare utformats speciellt för att acceptera galler och hålla dem under glasövergångstemperaturen i en vakuummiljö via ledande kylning. Exempelmiljön för VMXm möjliggör datainsamling med låg bakgrund, där provet är den återstående bakgrundskällan, och ger ett mikrobam som kan användas för att matcha kristaller med dimensioner under 10 μm. Denna provberedningsmetod kan också användas för att förbereda nanokristaler för elektrondiffraktion där det också finns ett krav på mycket lite överskottsvätska och ett glaskroppsprov på grund av svag penetration av elektroner. Medan cryoTEM-galler är bräckliga, kommer de som upplevs vid skörd av kristaller i slingor snabbt att anpassa sig till hanteringen av gallren. Med en liten mängd erfarenhet kommer få rutnät att gå förlorade under protokollets blotting-, frys- och laddningsstadier. Optimeringsstegen är dock avgörande för denna framgång och noggrann förberedelse kommer att minska chanserna att förlora kristaller eller minska kristallintegriteten.
CryoTEM-rutnät ger ett relativt stort enda fäste som kan innehålla många hundratals kristaller, vilket förbättrar genomströmningen där det bara kan vara möjligt att spela in en liten kil av diffraktionsdata. Ett enda rutnät kan också ge tillräckligt med kristaller för att bestämma proteinstrukturen, särskilt i kristaller med hög symmetri. Om endast en eller två enstaka kristalliseringsdroppar har genererat mikrokristaller, kan försöksblottning av kristalliseringsförhållandet ensam bidra till att säkerställa att när mikrokristallerna är blottade, är de använda tiderna så nära de som behövs för att generera initiala prover av god kvalitet. Kolfilmsstöden är osynliga för röntgenstrålar och finns med olika hålavstånd, som kan användas för att passa en viss morfologi. Vi använder oftast stödfilmer med 2 μm hål vid ett avstånd på 2 μm, men mindre hål med större avstånd kan vara lämpligare för kristaller som är mindre än 2 μm. Andra stödfilmer som de med 1 μm hål med ett avstånd på 4 μm samt stödfilmer med olika formade hål finns tillgängliga, som alla kommer att påverka blottningstiden. En rutnäts kvadratisk maskstorlek på 200 (200 rutor per tum) ger också tillräckligt med utrymme (~ 100 μm) mellan koppargallerstängerna så att röntgenstrålen inte starkt interagerar med kopparn samtidigt som den ger tillräckligt strukturellt stöd för kolfilmen laddad med kristaller. Användningen av flytande etan negerar behovet av kryoprotekter, vilket i sin tur minskar kravet på provvolym som skulle ha använts vid optimering av kryoprotektiva tillstånd.
De viktigaste parametrarna som ska optimeras under processen är blottningstiderna och provutspädningen. Blotting-tiderna bör vara tillräckligt långa för att observera “poppande” effekt över hela gallret innan de fryser. Över blotting kan resultera i uttorkning av kristallerna, men kontroll av luftfuktigheten i provkammaren används för att minimera denna effekt. Medan det föreslås att en relativ fuktighet på 90% används, kan vissa prover dra nytta av optimering av luftfuktigheten. Luftfuktigheten kan påverka blottingeffektiviteten hos blottingpapperet som långsamt kan bli mättat med vatten. Dessutom kan fuktighetskontroll i provkammaren användas för att förbättra diffraktionskvaliteten hos kristallerna30. Det rekommenderas att små förändringar (<5%) i luftfuktighet görs innan diffraktionsintegritet kontrolleras för att säkerställa att diffraktionskvaliteten inte försämras.
Optimering av icke-värdefulla prover kan utföras med hjälp av ett ljusmikroskop i stället för en SEM. Även om det är destruktivt är det användbart för att bedöma kristallernas densitet över nätet och för att möjliggöra beslutsfattande om huruvida ett prov ska spädas ut eller koncentreras för att bättre sprida kristaller över nätet. Detta steg är mest användbart när det finns ett stort antal kristaller tillgängliga och särskilt högkoncentrerade prover. Klumpa ihop kristaller bör undvikas (figur 3), eftersom det inte är ett betydande problem om två kristaller belyses samtidigt under datainsamlingen6,kommer det sannolikt att finnas en större vätskevolym runt klumpen, vilket minskar signalen till bruset(figur 5). Även om det är möjligt att observera stora överskott av vätska globalt över nätet med hjälp av ett ljusmikroskop, kan bedömning av vätskevolymen som omger mikrokristallerna och närvaron av kristallin is endast göras med hjälp av ett elektronmikroskop utrustat med ett kryogent vakuumöverföringssystem och steg. Ibland, efter applicering av kristallerna på gallret och innan blotting inträffar, kan kristaller i lösningar med låg viskositet sätta sig längs ena kanten av gallret. Vi har funnit att om man lägger till upp till 50% slutlig koncentration av etylenglykol kan det bromsa kristallens rörelse genom droppen, vilket säkerställer en bättre fördelning av mikrokristaller över nätet samt ger större kontroll över blotting genom att öka blottningstiden (figur 3D).
Vissa kristalliseringslösningar som innehåller trögflytande fällmedel som pegs med hög molekylvikt kan visa sig vara utmanande att fläcka, vilket kräver allt längre blottningstider (>10 s). I sådana fall kan det vara till hjälp att minska volymen av vätska som deponeras på baksidan av gallret samt volymen av kristallen som innehåller lösning på stödfilmsidan av nätet. Strategier som att använda 2 lager blotting papper eller glasfibrer kan också hjälpa blotting i dessa svåra fall31.
Medan denna rörledning är lämplig för lösliga proteinkristaller, utgör de som bildas i mycket trögflytande medier som membranproteiner i LCP en annan utmaning för vilken detta protokoll inte är lämpligt. Det håller dock på att utarbetas strategier för att förbereda LCP-kristaller på cryoTEM-nät för mikroED, vilket inkluderar att minska provernas viskositet genom att inducera en fasändring av LCP. Detta gör det möjligt att applicera proverna på rutnät på ett liknande sätt som det som beskrivs i den här artikeln. Slutligen kan provet fräsas med en fokuserad jonstråle för att avlägsna överskott av icke-kristallmaterial32,33,34.
Sammantaget tar denna pipeline i allmänhet 1-2 h (inklusive utrustningsinställningstid) att följa från provet som anländer till VMXm till att tillhandahålla optimerade galler med väl spridda, vitrifierade prover, beroende på provtillgänglighet, kristallkoncentrationen och kristalliseringslösningens viskositet. Dessa metoder har redan framgångsrikt använts för beredning av mikrokristaler för röntgendiffraktionsexperiment som utforskar strålningsskador på mikrokristaler där en minimal mängd vätska som omger provet var väsentlig28,35. Det bör noteras att protokollet kan tillämpas på alla lösliga mikrokristalprover, inte bara för väl diffractingprover som redan har optimerats. Ett kristalliseringsexperiment som producerar mikrokristallint material skulle traditionellt vara ett mål för optimering i syfte att erhålla större kristaller, men denna provberedningsmetod och VMXms kapacitet kan göra det möjligt att samla in adekvata data från sådana prover utan ytterligare optimering. Alternativt, om sådana mikrokristallinprover diffract dåligt, kan de data som samlas in från VMXm med hjälp av denna provberedningsmetod fortfarande fungera som en användbar guide för ytterligare optimering av kristalliseringsförhållanden. Verktygen för att förbereda galler, inklusive glödutladdning och dykfrysning, är nu allmänt tillgängliga i forskningsinstitut utrustade för cryoTEM-experiment och kommer att vara tillgängliga för många användare så att de kan förbereda prover före stråltid vid VMXm.
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill tacka Jeremy Keown, Jon Grimes, Geoff Sutton och Dave Stuart, STRUBI University of Oxford och Rachel Bolton, University of Southampton för att de vänligen tillhandahåller mikrokristala prover för utveckling och demonstration av provberedningsmetoder för VMXm-strållinjen förutom att möjliggöra idriftsering av strållinjen. Författarna vill också tacka iNEXT-Discovery (projektnummer 871037) för möjligheten och stödet vid publiceringen av detta manuskript.
Automated Cryo-EM plunge freezing instrument | Leica or ThermoFisher | Various | |
Benchtop light microscope with light source | Various | Various | |
Blade/Scalpel | Fisher Scientific | Various | |
CryoTEM Copper 200 mesh grids with carbon support film with 2 µm holes | Quantifoil | N1-C16nCu20-50 | |
CryoTEM grid storage boxes | Agar Scientific | AGG3727 | |
ddH2O | n/a | n/a | |
Ethane gas supply | n/a | n/a | |
Ethylene Glycol | Acros Organics | 146750010 | |
Glass microscope slides | FisherBrand | 12383118 | |
Glass petri dish | FisherBrand | 455732 | |
Glow discharging device | Pelco | 91000S | |
Laboratory wrapping film (Parafilm) | Bemis | HS234526B | |
Large and small, fine forceps | Agar Scientific | Various | |
Liquid nitrogen supply | n/a | n/a | |
Pipette tips | Various | Various | |
Pipetting devices | Various | Various | |
Sealing tape for crystallisation plates. | Molecular Dimensions | MD6-01 | |
Small/medium liquid nitrogen dewars | Spearlab | Various | |
Sprung circlip clipping tool | Subangstrom | SCT08 | |
Whatmann No.1 pre-cut filter paper | Leica | 16706440 |