Beoordeling van functionele statistieken van de gezondheid van skeletspieren in microtissues van menselijke skeletspieren
Summary
Dit manuscript beschrijft een gedetailleerd protocol om arrays van 3D menselijke skeletspierenmicrotissues en minimaal invasieve downstream in situ assays van functie te produceren, inclusief contractiele kracht en calciumbehandelingsanalyses.
Abstract
Driedimensionale (3D) in vitro modellen van skeletspieren zijn een waardevolle vooruitgang in biomedisch onderzoek omdat ze de mogelijkheid bieden om skeletspierreformatie en -functie te bestuderen in een schaalbaar formaat dat vatbaar is voor experimentele manipulaties. 3D-spierkweeksystemen zijn wenselijk omdat ze wetenschappers in staat stellen om skeletspieren ex vivo te bestuderen in de context van menselijke cellen. 3D in vitro modellen bootsen aspecten van de inheemse weefselstructuur van volwassen skeletspieren na. Hun universele toepassing wordt echter beperkt door de beschikbaarheid van platforms die eenvoudig te fabriceren, kosten- en gebruiksvriendelijk zijn en relatief grote hoeveelheden menselijke skeletspierweefsels opleveren. Bovendien, aangezien skeletspieren een belangrijke functionele rol spelen die in de loop van de tijd in veel ziektetoestanden wordt aangetast, is een experimenteel platform voor microtissue-studies het meest praktisch wanneer minimaal invasieve calciumtransiënte en contractiele krachtmetingen direct binnen het platform zelf kunnen worden uitgevoerd. In dit protocol wordt de fabricage van een 96-well platform dat bekend staat als ‘MyoTACTIC’, en de massale productie van 3D menselijke skeletspiermicrotissues (hMMTs) beschreven. Bovendien worden de methoden voor een minimaal invasieve toepassing van elektrische stimulatie gerapporteerd die herhaalde metingen van de skeletspierkracht en calciumbehandeling van elke microtissue in de loop van de tijd mogelijk maakt.
Introduction
Skeletspieren zijn een van de meest voorkomende weefsels in het menselijk lichaam en ondersteunen belangrijke lichaamsfuncties zoals voortbeweging, warmtehomeostase enmetabolisme 1. Historisch gezien zijn diermodellen en tweedimensionale (2D) celkweeksystemen gebruikt om biologische processen en ziektepathogenese te bestuderen, evenals voor het testen van farmacologische verbindingen bij de behandeling van skeletspierziekten2,3. Hoewel diermodellen onze kennis van skeletspieren in gezondheid en ziekte sterk hebben verbeterd, is hun translationele impact belemmerd door hoge kosten, ethische overwegingen en verschillen tussen soorten2,4. Bij het wenden tot menselijke celgebaseerde systemen om skeletspieren te bestuderen, zijn 2D-celkweeksystemen gunstig vanwege hun eenvoud. Er is echter een beperking. Dit formaat slaagt er vaak niet in om de cel-cel en cel-extracellulaire matrixinteracties samen te vatten die van nature in het lichaam voorkomen5,6. In de afgelopen jaren zijn driedimensionale (3D) skeletspiermodellen naar voren gekomen als een krachtig alternatief voor hele diermodellen en conventionele 2D-kweeksystemen door de modellering van fysiologisch en pathologisch relevante processen ex vivo7,8mogelijk temaken. Inderdaad, een overvloed aan studies hebben strategieën gerapporteerd om menselijke skeletspieren te modelleren in een bioartificiaal 3D-cultuurformaat1. Een beperking voor veel van deze studies is dat actieve kracht wordt gekwantificeerd na het verwijderen van de spierweefsels van de kweekplatforms en de hechting aan een krachtomvormer, die destructief is en daarom beperkt is tot het dienen als eindpunttest9,10,11,12,13,14,15,16,17,18 ,19,20,21. Anderen hebben kweeksystemen ontworpen die niet-invasieve methoden voor het meten van actieve kracht mogelijk maken, maar niet alle zijn geschikt voor toepassingen voor het testen van moleculen met een hoog gehalte7,8,9,10,14,18,22,23,24,25,26,27,28 ,29.
Dit protocol beschrijft een gedetailleerde methode om menselijke spiermicrotissues (hMMCT’s) te fabriceren in het skeletspieren (Myo) microTissue Array deviCe To Investigate forCe (MyoTACTIC) platform; een 96 well plate apparaat dat de bulkproductie van 3D skeletspier microtissuesondersteunt 30. De MyoTACTIC-plaatfabricagemethode maakt het mogelijk om in één gietstap een 96-put polydimethylsiloxaan (PDMS) kweekplaat en alle bijbehorende putkenmerken te genereren, waarbij elke put een relatief klein aantal cellen nodig heeft voor microtissuevorming. Microtissues gevormd binnen MyoTACTIC bevatten uitgelijnde, gestreepte en multinucleated myotubes die reproduceerbaar zijn van goed naar put van het apparaat, en bij rijping kunnen reageren op chemische en elektrische stimuli in situ30. Hierin worden de techniek om een PDMS MyoTACTIC-cultuurplaatapparaat te vervaardigen uit een replica van polyurethaan (PU), een geoptimaliseerde methode om onsterfelijke menselijke myogene voorlopercellen te implementeren om hMMT’s te fabriceren, en de functionele beoordeling van gemanipuleerde hMMT-krachtgeneratie en calciumbehandelingseigenschappen geschetst en besproken.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit manuscript beschrijft methoden om een 3D hMMT-cultuurmodel te fabriceren en te analyseren dat kan worden toegepast op studies van elementaire spierbiologie, ziektemodellering of voor het testen van kandidaat-moleculen. Het MyoTACTIC-platform is kostenvriendelijk, eenvoudig te produceren en vereist een relatief klein aantal cellen om microtissues van skeletspieren te produceren. hMMTs gevormd binnen het MyoTACTIC-cultuurplatform bestaan uit uitgelijnde, multinucleated en dwarsgestreepte myotubes en reageren op elektri…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We willen Mohammad Afshar, Haben Abraha, Mohsen Afshar-Bakooshli en Sadegh Davoudi bedanken voor hun bijdrage aan de uitvinding van het MyoTACTIC-cultuurplatform en het vaststellen van de fabricage- en analysemethoden die hierin worden beschreven. HL ontving financiering van een Natural Sciences and Engineering Research Council (NSERC) Training Program in Organ-on-a-Chip Engineering and Entrepreneurship Scholarship en een University of Toronto Wildcat graduate scholarships. PMG is de Canada Research Chair in Endogenous Repair en kreeg voor deze studie steun van het Ontario Institute for Regenerative Medicine, het Stem Cell Network en van Medicine by Design, een Canada First Research Excellence Program. Schematische diagrammen werden gemaakt met BioRender.com.
Materials
| 0.9% Saline Solution, Sterile | House Brand | 1010 | 10 mL aliquots of the solution are made and stored at 4°C |
| 25G Needle | BD, Medstore, University of Toronto | 2548-CABD305127 | |
| 6-Aminocaproic Acid, ≥99% (titration), Powder | Sigma – Aldrich | A2504-100G | A 50 mg / mL stock solution is generated by dissolving 5 mg of 6-aminocaproic acid powder in 100 mL of autoclaved, distilled water. The solution is vaccum filtered and 10 mL aliquots are stored at 4°C |
| 6.35 mm ID Tubing | VWR | 60985-528 | |
| AB1167 Myoblast Cell Line | Institut de Myologie (Paris, France) | ||
| Arbitrary Waveform Generator | Rigol | DG1022Z | |
| Basement Membrane Extract (Geltrex) | Thermo Fisher Scientific | A14132-02 | Stored as aliquots of 50 µL or 100 µL at -80°C |
| Benchtop Vacuum Chamber | Sigma – Aldrich | D2672 | |
| BNC to Aligator Clip Cable | Ordered from Amazon | ||
| Culture Plastics | Sarstedt | Includes culture plates, serological pipettes, etc | |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma – Aldrich | D8418-250ML | |
| DPBS, Powder, No Calcium, No Magnesium | Thermo Fisher Scientific | 21600069 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (1X) | Gibco | 11995-065 | This is a high glucose DMEM with L-glutamine and sodium pyruvate |
| Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | 10437028 | |
| Fibrinogen from Bovine Plasma | Sigma – Aldrich | F8630-5G | Aliquots ranging from 7 – 10 mg of fibrinogen powder are made and stored at -20°C |
| Filtropur Syringe Filter, 0.22um Pore Size | Sarstedt | 83.1826.001 | |
| Horse Serum | Gibco | 16050-122 | |
| Human Recombinant Insulin | Sigma – Aldrich | 91077C | Stock solution is 100X and made by dissolving 1 mg of human recombinant insulin in 1 mL of DMEM and 1 µL of NaOH 10N. Solution is filtered and stored as 1 mL aliquots at 4°C |
| Image Acquisition Software | Olympus | cellSens Dimension | |
| Image Processing Software | National Institutes of Health | ImageJ | |
| Isotemp Oven | Thermo Fisher Scientific | 201 | |
| Microscope | Olympus | IX83 | |
| Microscope – Camera Mount | Labcam | Labcam for iPhone | Ordered from Amazon |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140-122 | |
| Plastic Disposable Syringes, 1cc | BD | 2606-309659 | |
| Plastic Disposable Syringes, 50cc | BD | 2612-309653 | |
| Pluronic F-127, Powder, BioReagent | Sigma – Aldrich | P2443-250G | A 5% stock solution of pluronic acid is made by dissolving 5 g of pluronic acid powder in 100 mL of chilled, autoclaved, distilled water. The solution is vaccum filtered and 10 mL aliquots are stored at 4°C |
| Polydimethylsiloxane (Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit) | Dow | 4019862 | Kits are also available at Thermo Fisher Scientific, Sigma – Aldrich, etc. |
| Polyurethane Negative Mold | In House | ||
| Release Agent | Mann Release Technologies | 200 | |
| Rotary Vane Vacuum Pump | Edwards | A65401906 | |
| Scalpel | Almedic, Medstore, University of Toronto | 2586-M36-0100 | |
| Single Edge Razor Blade | VWR | 55411-050 | |
| Skeletal Muscle Cell Basal Medium | Promocell | C-23260 | 30 mL aliquotes are generated and at stored at 4°C. |
| Skeletal Muscle Cell Growth Medium (Ready-to-use) | Promocell | C-23060 | 42 mL aliquots are generated and stored at 4°C. |
| Smartphone (iPhone) | Apple | SE | |
| Standard Duty Dry Vacuum Pump | Welch | 2546B-01 | |
| Sterilization Bag | Alliance | 211-SCM2 | |
| Thimble | Igege | Ordered from Amazon | |
| Thrombin from human plasma | Sigma – Aldrich | T6884-250UN | 100 units of thrombin is dissolved in 1 mL of a 0.1% BSA solution. 10 µL aliquots are prepared and stored at – 20°C. |
| Tin coated copper wire | Arco | B8871K48 | Ordered from Amazon |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Scientific | 15250061 | |
| Trypsin-EDTA, 0.25% | Thermo FIsher Scientific | 25200072 | |
| Vacuum Chamber 2 | SP Bel-Art | F42027-0000 |
Referências
- Frontera, W. R., Ochala, J. Skeletal Muscle: A brief review of structure and function. Calcified Tissue International. 96 (3), 183-195 (2015).
- McGreevy, J. W., Hakim, C. H., McIntosh, M. A., Duan, D. Animal models of Duchenne muscular dystrophy: From basic mechanisms to gene therapy. DMM Disease Models and Mechanisms. 8 (3), 195-213 (2015).
- Young, J., et al. MyoScreen, a high-throughput phenotypic screening platform enabling muscle drug discovery. SLAS Discovery. 23 (8), 790-806 (2018).
- DiMasi, J. A., Hansen, R. W., Grabowski, H. G. The price of innovation: New estimates of drug development costs. Journal of Health Economics. 22 (2), 151-185 (2003).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).
- Duval, K., et al. Modeling physiological events in 2D vs. 3D cell culture. Physiology. 32 (4), 266-277 (2017).
- Vandenburgh, H., et al. Drug-screening platform based on the contractility of tissue-engineered muscle. Muscle and Nerve. 37 (4), 438-447 (2008).
- Vandenburgh, H., et al. Automated drug screening with contractile muscle tissue engineered from dystrophic myoblasts. The FASEB Journal. 23 (10), 3325-3334 (2009).
- Kim, J. H., et al. 3D bioprinted human skeletal muscle constructs for muscle function restoration. Scientific Reports. 8 (1), 12307 (2018).
- Takahashi, H., Shimizu, T., Okano, T. Engineered human contractile myofiber sheets as a platform for studies of skeletal muscle physiology. Scientific Reports. 8 (1), 1-11 (2018).
- Afshar Bakooshli, M., et al. A 3D culture model of innervated human skeletal muscle enables studies of the adult neuromuscular junction. eLife. 8, 1-29 (2019).
- Madden, L., Juhas, M., Kraus, W. E., Truskey, G. A., Bursac, N. Bioengineered human myobundles mimic clinical responses of skeletal muscle to drugs. eLife. 2015 (4), 3-5 (2015).
- Urciuolo, A., et al. Engineering a 3D in vitro model of human skeletal muscle at the single fiber scale. PLoS One. 15 (5), 0232081 (2020).
- Cvetkovic, C., Rich, M. H., Raman, R., Kong, H., Bashir, R. A 3D-printed platform for modular neuromuscular motor units. Microsystems & Nanoengineering. 3 (1), 1-9 (2017).
- Shima, A., Morimoto, Y., Sweeney, H. L., Takeuchi, S. Three-dimensional contractile muscle tissue consisting of human skeletal myocyte cell line. Experimental Cell Research. 370 (1), 168-173 (2018).
- Capel, A. J., et al. Scalable 3D printed molds for human tissue engineered skeletal muscle. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 20 (2019).
- Gholobova, D., et al. Human tissue-engineered skeletal muscle: a novel 3D in vitro model for drug disposition and toxicity after intramuscular injection. Scientific Reports. 8 (1), 1-14 (2018).
- Osaki, T., Uzel, S. G. M., Kamm, R. D. Microphysiological 3D model of amyotrophic lateral sclerosis (ALS) from human iPS-derived muscle cells and optogenetic motor neurons. Science Advances. 4 (10), 5847 (2018).
- Rao, L., Qian, Y., Khodabukus, A., Ribar, T., Bursac, N. Engineering human pluripotent stem cells into a functional skeletal muscle tissue. Nature Communications. 9 (1), (2018).
- Maffioletti, S. M., et al. Three-dimensional human iPSC-derived artificial skeletal muscles model muscular dystrophies and enable multilineage tissue engineering. Cell Reports. 23 (3), 899-908 (2018).
- Chal, J., et al. Generation of human muscle fibers and satellite-like cells from human pluripotent stem cells in vitro. Nature Protocols. 11 (10), 1833-1850 (2016).
- Khodabukus, A., et al. Electrical stimulation increases hypertrophy and metabolic flux in tissue-engineered human skeletal muscle. Biomaterials. 198, 259-269 (2019).
- Nagashima, T., et al. In vitro model of human skeletal muscle tissues with contractility fabricated by immortalized human myogenic cells. Advanced Biosystems. , 2000121 (2020).
- Mills, R. J., et al. Development of a human skeletal micro muscle platform with pacing capabilities. Biomaterials. 198, 217-227 (2019).
- Legant, W. R., et al. Microfabricated tissue gauges to measure and manipulate forces from 3D microtissues. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (25), 10097-10102 (2009).
- Prüller, J., Mannhardt, I., Eschenhagen, T., Zammit, P. S., Figeac, N. Satellite cells delivered in their niche efficiently generate functional myotubes in three-dimensional cell culture. PLOS One. 13 (9), 0202574 (2018).
- Sakar, M. S., et al. Formation and optogenetic control of engineered 3D skeletal muscle bioactuators. Lab on a Chip. 12 (23), 4976-4985 (2012).
- Zhang, X., et al. A system to monitor statin-induced myopathy in individual engineered skeletal muscle myobundles. Lab on a Chip. 18 (18), 2787-2796 (2018).
- Rajabian, N., et al. Bioengineered skeletal muscle as a model of muscle aging and regeneration. Tissue Engineering Part A. 27 (1-2), 74-86 (2020).
- Afshar, M. E., et al. A 96-well culture platform enables longitudinal analyses of engineered human skeletal muscle microtissue strength. Scientific Reports. 10 (1), 6918 (2020).
- Mamchaoui, K., et al. Immortalized pathological human myoblasts: Towards a universal tool for the study of neuromuscular disorders. Skeletal Muscle. 1 (1), 34 (2011).
- Halldorsson, S., Lucumi, E., Gómez-Sjöberg, R., Fleming, R. M. T. Advantages and challenges of microfluidic cell culture in polydimethylsiloxane devices. Biosensors and Bioelectronics. 63, 218-231 (2015).
- Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Bakooshli, M. A., et al. A 3D model of human skeletal muscle innervated with stem cell-derived motor neurons enables epsilon-subunit targeted myasthenic syndrome studies. BioRxiv. , 275545 (2018).
- Vandenburgh, H. H., Karlisch, P., Farr, L. Maintenance of highly contractile tissue-cultured avian skeletal myotubes in collagen gel. Vitro Cellular & Developmental Biology. 24 (3), 166-174 (1988).
- Bell, E., Ivarsson, B., Merrill, C. Production of a tissue-like structure by contraction of collagen lattices by human fibroblasts of different proliferative potential in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (3), 1274-1278 (1979).
- Hinds, S., Bian, W., Dennis, R. G., Bursac, N. The role of extracellular matrix composition in structure and function of bioengineered skeletal muscle. Biomaterials. 32 (14), 3575-3583 (2011).
