Bewertung funktioneller Metriken der Skelettmuskelgesundheit in Mikrobeschwerden der menschlichen Skelettmuskulatur
Summary
Dieses Manuskript beschreibt ein detailliertes Protokoll zur Herstellung von Arrays von 3D-Mikrogeweben der menschlichen Skelettmuskulatur und minimalinvasiven Downstream-In-situ-Funktionsassays, einschließlich kontraktiler Kraft- und Kalziumhandhabungsanalysen.
Abstract
Dreidimensionale (3D) In-vitro-Modelle der Skelettmuskulatur sind ein wertvoller Fortschritt in der biomedizinischen Forschung, da sie die Möglichkeit bieten, die Reform und Funktion der Skelettmuskulatur in einem skalierbaren Format zu untersuchen, das experimentellen Manipulationen zugänglich ist. 3D-Muskelkultursysteme sind wünschenswert, da sie es Wissenschaftlern ermöglichen, skelettierte Muskeln ex vivo im Kontext menschlicher Zellen zu untersuchen. 3D-In-vitro-Modelle ahmen Aspekte der nativen Gewebestruktur der erwachsenen Skelettmuskulatur genau nach. Ihre universelle Anwendung ist jedoch durch die Verfügbarkeit von Plattformen begrenzt, die einfach herzustellen, kostengünstig und benutzerfreundlich sind und relativ hohe Mengen an menschlichem Skelettmuskelgewebe liefern. Da die Skelettmuskulatur eine wichtige funktionelle Rolle spielt, die im Laufe der Zeit in vielen Krankheitszuständen beeinträchtigt wird, ist eine experimentelle Plattform für Mikrorisikostudien am praktischsten, wenn minimal-invasive Messungen der transienten und kontraktilen Kalziumkraft direkt in der Plattform selbst durchgeführt werden können. In diesem Protokoll wird die Herstellung einer 96-Well-Plattform namens “MyoTACTIC” und die Massenproduktion von 3D-Mikrogeweben (hMMTs) für menschliche Skelettmuskeln beschrieben. Darüber hinaus werden die Methoden für eine minimalinvasive Anwendung der elektrischen Stimulation beschrieben, die wiederholte Messungen der Skelettmuskelkraft und der Kalziumhandhabung jedes Mikrogewebes im Laufe der Zeit ermöglicht.
Introduction
Die Skelettmuskulatur ist eines der am häufigsten vorkommenden Gewebe im menschlichen Körper und unterstützt wichtige Körperfunktionen wie Fortbewegung, Wärmehomöostase und Stoffwechsel1. In der Vergangenheit wurden Tiermodelle und zweidimensionale (2D) Zellkultursysteme verwendet, um biologische Prozesse und Krankheitspathogenese sowie pharmakologische Verbindungen bei der Behandlung von Skelettmuskelerkrankungen zu untersuchen2,3. Während Tiermodelle unser Wissen über die Skelettmuskulatur in Gesundheit und Krankheit stark verbessert haben, wurde ihre translationale Wirkung durch hohe Kosten, ethische Überlegungen und Unterschiede zwischen den Artenbehindert 2,4. Bei der Hinwendung zu menschlichen zellbasierten Systemen zur Untersuchung der Skelettmuskulatur sind 2D-Zellkultursysteme aufgrund ihrer Einfachheit günstig. Es gibt jedoch eine Einschränkung. Dieses Format versäumt es oft, die Zell-Zell- und Zell-extrazellulären Matrix-Interaktionen zu rekapitulieren, die natürlich im Körper auftreten5,6. In den letzten Jahren haben sich dreidimensionale (3D) Skelettmuskelmodelle als leistungsfähige Alternative zu Ganzentiermodellen und herkömmlichen 2D-Kultursystemen herauskristallisiert, indem sie die Modellierung physiologisch und pathologisch relevanter Prozesse ex vivoermöglichen 7,8. Tatsächlich haben eine Vielzahl von Studien über Strategien zur Modellierung der menschlichen Skelettmuskulatur in einem bioartifiziellen 3D-Kulturformatberichtet 1. Eine Einschränkung für viele dieser Studien besteht darin, dass die aktive Kraft nach der Entfernung des Muskelgewebes von den Kulturplattformen und der Befestigung an einem Kraftaufnehmer quantifiziert wird, was destruktiv ist und daher darauf beschränkt ist, als Endpunkt-Assay zu dienen9,10,11,12,13,14,15,16,17,18 ,19,20,21. Andere haben Kultursysteme entwickelt, die nicht-invasive Methoden zur Messung der Wirkkraft ermöglichen, aber nicht alle sind für Molekültestanwendungen mit hohem Gehalt geeignet7,8,9,10,14,18,22,23,24,25,26,27,28 ,29.
Dieses Protokoll beschreibt eine detaillierte Methode zur Herstellung von Human Muscle Microtissues (hMMTs) in der Skelettmuskel (Myo) microTissue Array deviCe To Investigate forCe (MyoTACTIC) Plattform; ein 96-Well-Plate-Gerät, das die Massenproduktion von 3D-Skelettmuskel-Mikrogeweben30unterstützt. Die MyoTACTIC-Plattenherstellungsmethode ermöglicht die Erzeugung einer 96-Well-Polydimethylsiloxan (PDMS)-Kulturplatte und aller entsprechenden Well-Merkmale in einem einzigen Gießschritt, wobei jede Vertiefung eine relativ kleine Anzahl von Zellen für die Bildung von Mikrogeweben benötigt. Mikrogewebe, die in MyoTACTIC gebildet werden, enthalten ausgerichtete, gestreifte und mehrkernige Myotuben, die von Gut zu Brunnen des Geräts reproduzierbar sind und bei Reifung auf chemische und elektrische Reize in situ reagieren können30. Hierin werden die Technik zur Herstellung eines PDMS MyoTACTIC-Kulturplattengeräts aus einer Polyurethan (PU)-Replik, eine optimierte Methode zur Implementierung immortalisierter menschlicher myogener Vorläuferzellen zur Herstellung von hMMTs und die funktionelle Bewertung der technischen hMMT-Krafterzeugung und der Calciumhandhabungseigenschaften skizziert und diskutiert.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Manuskript beschreibt Methoden zur Herstellung und Analyse eines 3D-hMMT-Kulturmodells, das auf Studien der grundlegenden Muskelbiologie, Krankheitsmodellierung oder für die Prüfung von Kandidatenmolekülen angewendet werden kann. Die MyoTACTIC-Plattform ist kostengünstig, einfach herzustellen und benötigt eine relativ kleine Anzahl von Zellen, um Skelettmuskel-Mikrogewebe herzustellen. hMMTs, die innerhalb der MyoTACTIC-Kulturplattform gebildet werden, bestehen aus ausgerichteten, mehrkernigen und quergestrei…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Mohammad Afshar, Haben Abraha, Mohsen Afshar-Bakooshli und Sadegh Davoudi für ihren Beitrag zur Erfindung der MyoTACTIC-Kulturplattform und zur Etablierung der hier beschriebenen Herstellungs- und Analysemethoden. HL erhielt Mittel aus einem Natural Sciences and Engineering Research Council (NSERC) Training Program in Organ-on-a-Chip Engineering and Entrepreneurship Scholarship und einem University of Toronto Wildcat Graduate Scholarship. PMG ist der Canada Research Chair in Endogenous Repair und erhielt für diese Studie Unterstützung vom Ontario Institute for Regenerative Medicine, dem Stem Cell Network und von Medicine by Design, einem Canada First Research Excellence Program. Schematische Diagramme wurden mit BioRender.com erstellt.
Materials
| 0.9% Saline Solution, Sterile | House Brand | 1010 | 10 mL aliquots of the solution are made and stored at 4°C |
| 25G Needle | BD, Medstore, University of Toronto | 2548-CABD305127 | |
| 6-Aminocaproic Acid, ≥99% (titration), Powder | Sigma – Aldrich | A2504-100G | A 50 mg / mL stock solution is generated by dissolving 5 mg of 6-aminocaproic acid powder in 100 mL of autoclaved, distilled water. The solution is vaccum filtered and 10 mL aliquots are stored at 4°C |
| 6.35 mm ID Tubing | VWR | 60985-528 | |
| AB1167 Myoblast Cell Line | Institut de Myologie (Paris, France) | ||
| Arbitrary Waveform Generator | Rigol | DG1022Z | |
| Basement Membrane Extract (Geltrex) | Thermo Fisher Scientific | A14132-02 | Stored as aliquots of 50 µL or 100 µL at -80°C |
| Benchtop Vacuum Chamber | Sigma – Aldrich | D2672 | |
| BNC to Aligator Clip Cable | Ordered from Amazon | ||
| Culture Plastics | Sarstedt | Includes culture plates, serological pipettes, etc | |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma – Aldrich | D8418-250ML | |
| DPBS, Powder, No Calcium, No Magnesium | Thermo Fisher Scientific | 21600069 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (1X) | Gibco | 11995-065 | This is a high glucose DMEM with L-glutamine and sodium pyruvate |
| Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | 10437028 | |
| Fibrinogen from Bovine Plasma | Sigma – Aldrich | F8630-5G | Aliquots ranging from 7 – 10 mg of fibrinogen powder are made and stored at -20°C |
| Filtropur Syringe Filter, 0.22um Pore Size | Sarstedt | 83.1826.001 | |
| Horse Serum | Gibco | 16050-122 | |
| Human Recombinant Insulin | Sigma – Aldrich | 91077C | Stock solution is 100X and made by dissolving 1 mg of human recombinant insulin in 1 mL of DMEM and 1 µL of NaOH 10N. Solution is filtered and stored as 1 mL aliquots at 4°C |
| Image Acquisition Software | Olympus | cellSens Dimension | |
| Image Processing Software | National Institutes of Health | ImageJ | |
| Isotemp Oven | Thermo Fisher Scientific | 201 | |
| Microscope | Olympus | IX83 | |
| Microscope – Camera Mount | Labcam | Labcam for iPhone | Ordered from Amazon |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140-122 | |
| Plastic Disposable Syringes, 1cc | BD | 2606-309659 | |
| Plastic Disposable Syringes, 50cc | BD | 2612-309653 | |
| Pluronic F-127, Powder, BioReagent | Sigma – Aldrich | P2443-250G | A 5% stock solution of pluronic acid is made by dissolving 5 g of pluronic acid powder in 100 mL of chilled, autoclaved, distilled water. The solution is vaccum filtered and 10 mL aliquots are stored at 4°C |
| Polydimethylsiloxane (Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit) | Dow | 4019862 | Kits are also available at Thermo Fisher Scientific, Sigma – Aldrich, etc. |
| Polyurethane Negative Mold | In House | ||
| Release Agent | Mann Release Technologies | 200 | |
| Rotary Vane Vacuum Pump | Edwards | A65401906 | |
| Scalpel | Almedic, Medstore, University of Toronto | 2586-M36-0100 | |
| Single Edge Razor Blade | VWR | 55411-050 | |
| Skeletal Muscle Cell Basal Medium | Promocell | C-23260 | 30 mL aliquotes are generated and at stored at 4°C. |
| Skeletal Muscle Cell Growth Medium (Ready-to-use) | Promocell | C-23060 | 42 mL aliquots are generated and stored at 4°C. |
| Smartphone (iPhone) | Apple | SE | |
| Standard Duty Dry Vacuum Pump | Welch | 2546B-01 | |
| Sterilization Bag | Alliance | 211-SCM2 | |
| Thimble | Igege | Ordered from Amazon | |
| Thrombin from human plasma | Sigma – Aldrich | T6884-250UN | 100 units of thrombin is dissolved in 1 mL of a 0.1% BSA solution. 10 µL aliquots are prepared and stored at – 20°C. |
| Tin coated copper wire | Arco | B8871K48 | Ordered from Amazon |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Scientific | 15250061 | |
| Trypsin-EDTA, 0.25% | Thermo FIsher Scientific | 25200072 | |
| Vacuum Chamber 2 | SP Bel-Art | F42027-0000 |
Referências
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