Valutazione delle metriche funzionali della salute del muscolo scheletrico nei microtessuti muscolari scheletrici umani
Summary
Questo manoscritto descrive un protocollo dettagliato per produrre matrici di microtessuti del muscolo scheletrico umano 3D e saggi di funzione minimamente invasivi a valle in situ, comprese le analisi della forza contrattile e della manipolazione del calcio.
Abstract
I modelli tridimensionali (3D) in vitro del muscolo scheletrico sono un prezioso progresso nella ricerca biomedica in quanto offrono l’opportunità di studiare la riforma e la funzione del muscolo scheletrico in un formato scalabile che è suscettibile di manipolazioni sperimentali. I sistemi di coltura muscolare 3D sono desiderabili in quanto consentono agli scienziati di studiare il muscolo scheletrico ex vivo nel contesto delle cellule umane. I modelli 3D in vitro imitano da vicino gli aspetti della struttura tissutale nativa del muscolo scheletrico adulto. Tuttavia, la loro applicazione universale è limitata dalla disponibilità di piattaforme semplici da fabbricare, costose e facili da usare e producono quantità relativamente elevate di tessuti muscolari scheletrici umani. Inoltre, poiché il muscolo scheletrico svolge un importante ruolo funzionale che è compromesso nel tempo in molti stati patologici, una piattaforma sperimentale per studi di microtissue è più pratica quando le misurazioni minimamente invasive del calcio transitorio e della forza contrattile possono essere condotte direttamente all’interno della piattaforma stessa. In questo protocollo, viene descritta la fabbricazione di una piattaforma a 96 pozzi nota come “MyoTACTIC” e la produzione in massa di microtissue del muscolo scheletrico umano 3D (hMMT). Inoltre, vengono riportati i metodi per un’applicazione minimamente invasiva della stimolazione elettrica che consente misurazioni ripetute della forza muscolare scheletrica e della manipolazione del calcio di ciascuna microtessuta nel tempo.
Introduction
Il muscolo scheletrico è uno dei tessuti più abbondanti nel corpo umano e supporta funzioni chiave del corpo come la locomozione, l’omeostasi del calore e il metabolismo1. Storicamente, modelli animali e sistemi di coltura cellulare bidimensionali (2D) sono stati utilizzati per studiare i processi biologici e la patogenesi della malattia, nonché per testare composti farmacologici nel trattamento delle malattie del muscolo scheletrico2,3. Mentre i modelli animali hanno notevolmente migliorato la nostra conoscenza del muscolo scheletrico in salute e nelle malattie, il loro impatto traslazionale è stato ostacolato da costi elevati, considerazioni etiche e differenze interspecie2,4. Rivolgendosi ai sistemi basati su cellule umane per studiare il muscolo scheletrico, i sistemi di coltura cellulare 2D sono favorevoli grazie alla loro semplicità. Tuttavia, c’è una limitazione. Questo formato spesso non riesce a ricapitolare le interazioni cellula-cellula e cellula-matrice extracellulare che si verificano naturalmente all’interno del corpo5,6. Negli ultimi anni, i modelli di muscolo scheletrico tridimensionale (3D) sono emersi come una potente alternativa ai modelli animali interi e ai sistemi di coltura 2D convenzionali consentendo la modellazione di processi fisiologicamente e patologicamente rilevanti ex vivo7,8. In effetti, una pletora di studi ha riportato strategie per modellare il muscolo scheletrico umano in un formato di coltura 3D bioartificiale1. Una limitazione per molti di questi studi è che la forza attiva viene quantificata in seguito alla rimozione dei tessuti muscolari dalle piattaforme di coltura e all’attaccamento a un trasduttore di forza, che è distruttivo e quindi limitato a servire come endpoint assay9,10,11,12,13,14,15,16,17,18 ,19,20,21. Altri hanno progettato sistemi di coltura che consentono metodi non invasivi di misurazione della forza attiva, ma non tutti sono suscettibili di applicazioni di test molecolari ad alto contenuto7,8,9,10,14,18,22, 23,24,25,26,27,28 ,29.
Questo protocollo descrive un metodo dettagliato per fabbricare microtessuti muscolari umani (hMMT) nella piattaforma microTissue Array deviCe To Investigate forCe (MyoTACTIC) del muscolo scheletrico (MyoTACTIC); un dispositivo a piastra a 96 pozzetti che supporta la produzione in blocco di microtissue del muscolo scheletrico 3D30. Il metodo di fabbricazione della piastra MyoTACTIC consente la generazione di una piastra di coltura da 96 pozzettilsilossano (PDMS) e tutte le caratteristiche corrispondenti del pozzo in una singola fase di fusione, per cui ogni pozzo richiede un numero relativamente piccolo di cellule per la formazione di microtessuti. I microsessu formati all’interno di MyoTACTIC contengono miotubi allineati, striati e multinucleati che sono riproducibili da un pozzo all’altro del dispositivo e, una volta maturati, possono rispondere a stimoli chimici ed elettrici in situ30. Qui, la tecnica per produrre un dispositivo a piastra di coltura PDMS MyoTACTIC da una replica in poliuretano (PU), un metodo ottimizzato per implementare cellule progenitrici miogeniche umane immortalizzate per fabbricare hMMT e la valutazione funzionale della generazione di forza hMMT ingegnerizzata e delle proprietà di manipolazione del calcio sono delineate e discusse.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo manoscritto descrive i metodi per fabbricare e analizzare un modello di coltura hMMT 3D che può essere applicato a studi di biologia muscolare di base, modellazione di malattie o per test di molecole candidate. La piattaforma MyoTACTIC è economica, facile da produrre e richiede un numero relativamente piccolo di cellule per produrre microtessuti muscolari scheletrici. Gli hMMT formati all’interno della piattaforma di coltura MyoTACTIC sono composti da miotubi allineati, multinucleati e striati e rispondono agli …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vorremmo ringraziare Mohammad Afshar, Haben Abraha, Mohsen Afshar-Bakooshli e Sadegh Davoudi per aver contribuito all’invenzione della piattaforma culturale MyoTACTIC e per aver stabilito i metodi di fabbricazione e analisi descritti nel presente documento. HL ha ricevuto finanziamenti da un programma di formazione del Natural Sciences and Engineering Research Council (NSERC) in Organ-on-a-Chip Engineering and Entrepreneurship Scholarship e da una borsa di studio per laureati Wildcat dell’Università di Toronto. PMG è la cattedra di ricerca canadese in riparazione endogena e ha ricevuto supporto per questo studio dall’Ontario Institute for Regenerative Medicine, dalla Stem Cell Network e da Medicine by Design, un canada first research excellence program. I diagrammi schematici sono stati creati con BioRender.com.
Materials
| 0.9% Saline Solution, Sterile | House Brand | 1010 | 10 mL aliquots of the solution are made and stored at 4°C |
| 25G Needle | BD, Medstore, University of Toronto | 2548-CABD305127 | |
| 6-Aminocaproic Acid, ≥99% (titration), Powder | Sigma – Aldrich | A2504-100G | A 50 mg / mL stock solution is generated by dissolving 5 mg of 6-aminocaproic acid powder in 100 mL of autoclaved, distilled water. The solution is vaccum filtered and 10 mL aliquots are stored at 4°C |
| 6.35 mm ID Tubing | VWR | 60985-528 | |
| AB1167 Myoblast Cell Line | Institut de Myologie (Paris, France) | ||
| Arbitrary Waveform Generator | Rigol | DG1022Z | |
| Basement Membrane Extract (Geltrex) | Thermo Fisher Scientific | A14132-02 | Stored as aliquots of 50 µL or 100 µL at -80°C |
| Benchtop Vacuum Chamber | Sigma – Aldrich | D2672 | |
| BNC to Aligator Clip Cable | Ordered from Amazon | ||
| Culture Plastics | Sarstedt | Includes culture plates, serological pipettes, etc | |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma – Aldrich | D8418-250ML | |
| DPBS, Powder, No Calcium, No Magnesium | Thermo Fisher Scientific | 21600069 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (1X) | Gibco | 11995-065 | This is a high glucose DMEM with L-glutamine and sodium pyruvate |
| Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | 10437028 | |
| Fibrinogen from Bovine Plasma | Sigma – Aldrich | F8630-5G | Aliquots ranging from 7 – 10 mg of fibrinogen powder are made and stored at -20°C |
| Filtropur Syringe Filter, 0.22um Pore Size | Sarstedt | 83.1826.001 | |
| Horse Serum | Gibco | 16050-122 | |
| Human Recombinant Insulin | Sigma – Aldrich | 91077C | Stock solution is 100X and made by dissolving 1 mg of human recombinant insulin in 1 mL of DMEM and 1 µL of NaOH 10N. Solution is filtered and stored as 1 mL aliquots at 4°C |
| Image Acquisition Software | Olympus | cellSens Dimension | |
| Image Processing Software | National Institutes of Health | ImageJ | |
| Isotemp Oven | Thermo Fisher Scientific | 201 | |
| Microscope | Olympus | IX83 | |
| Microscope – Camera Mount | Labcam | Labcam for iPhone | Ordered from Amazon |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140-122 | |
| Plastic Disposable Syringes, 1cc | BD | 2606-309659 | |
| Plastic Disposable Syringes, 50cc | BD | 2612-309653 | |
| Pluronic F-127, Powder, BioReagent | Sigma – Aldrich | P2443-250G | A 5% stock solution of pluronic acid is made by dissolving 5 g of pluronic acid powder in 100 mL of chilled, autoclaved, distilled water. The solution is vaccum filtered and 10 mL aliquots are stored at 4°C |
| Polydimethylsiloxane (Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit) | Dow | 4019862 | Kits are also available at Thermo Fisher Scientific, Sigma – Aldrich, etc. |
| Polyurethane Negative Mold | In House | ||
| Release Agent | Mann Release Technologies | 200 | |
| Rotary Vane Vacuum Pump | Edwards | A65401906 | |
| Scalpel | Almedic, Medstore, University of Toronto | 2586-M36-0100 | |
| Single Edge Razor Blade | VWR | 55411-050 | |
| Skeletal Muscle Cell Basal Medium | Promocell | C-23260 | 30 mL aliquotes are generated and at stored at 4°C. |
| Skeletal Muscle Cell Growth Medium (Ready-to-use) | Promocell | C-23060 | 42 mL aliquots are generated and stored at 4°C. |
| Smartphone (iPhone) | Apple | SE | |
| Standard Duty Dry Vacuum Pump | Welch | 2546B-01 | |
| Sterilization Bag | Alliance | 211-SCM2 | |
| Thimble | Igege | Ordered from Amazon | |
| Thrombin from human plasma | Sigma – Aldrich | T6884-250UN | 100 units of thrombin is dissolved in 1 mL of a 0.1% BSA solution. 10 µL aliquots are prepared and stored at – 20°C. |
| Tin coated copper wire | Arco | B8871K48 | Ordered from Amazon |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Scientific | 15250061 | |
| Trypsin-EDTA, 0.25% | Thermo FIsher Scientific | 25200072 | |
| Vacuum Chamber 2 | SP Bel-Art | F42027-0000 |
Referências
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