ヒト骨格筋微小組織における骨格筋の健康の機能指標の評価
Summary
本稿は、収縮力やカルシウム処理分析を含む機能の機能アッセイにおいて、3Dヒト骨格筋微小組織および低侵襲下流部のアレイを生成するための詳細なプロトコルを記述する。
Abstract
骨格筋の3次元(3D)インビトロモデルは、骨格筋の改革と機能を実験的操作に適したスケーラブルな形式で研究する機会を得て、生物医学研究における貴重な進歩です。3D筋肉培養システムは、科学者がヒト細胞の文脈で骨格筋ex vivoを研究することを可能にするので望ましい。3D in vitroモデルは、成人骨格筋のネイティブ組織構造の側面を密接に模倣する。しかし、彼らの普遍的なアプリケーションは、製造が簡単で、コストとユーザーフレンドリーで、比較的大量のヒト骨格筋組織を生み出すプラットフォームの可用性によって制限されています。さらに、骨格筋は、多くの疾患状態において時間の経過とともに損なわれる重要な機能的役割を担うため、微小組織研究のための実験的プラットフォームは、低侵襲性カルシウム過渡性および収縮力測定をプラットフォーム内で直接行うことができる場合に最も実用的である。このプロトコルでは、’MyoTACTIC’として知られている96ウェルプラットフォームの製造、および3Dヒト骨格筋微小組織(hMMT)の大量生産について説明する。また、経時的に各細組織の骨格筋力やカルシウムの取り扱いの繰り返し測定を可能にする電気刺激の低侵襲適用方法が報告されている。
Introduction
骨格筋は、人体で最も豊富な組織の一つであり、移動、熱恒常性および代謝などの主要な身体機能をサポートしています1.歴史的に、動物モデルおよび2次元(2D)細胞培養システムは、生物学的プロセスおよび疾患の病態を研究し、骨格筋疾患2,3の治療における薬理学的化合物を試験するために用いられてきた。動物モデルは健康や病気における骨格筋に関する知識を大幅に改善しましたが、その翻訳的影響は高コスト、倫理的配慮、種間の違い2、4によって妨げられています。骨格筋を研究するためにヒト細胞系に目を向けると、2D細胞培養システムは単純性のために良好である。ただし、制限があります。この形式は、多くの場合、体内5,6内で自然に起こる細胞細胞および細胞外マトリックス相互作用を再現できない。ここ数年、3次元(3D)骨格筋モデルは、生理学的および病理学的に関連するプロセスex vivo7,8のモデリングを可能にすることにより、動物モデル全体および従来の2D培養系に代わる強力な代替手段として登場してきた。実際、多くの研究は、人工的な3D培養形式1でヒト骨格筋をモデル化する戦略を報告している。これらの研究の多くのための1つの制限は、活性力が培養プラットフォームからの筋肉組織の除去と力トランスデューサーへの付着に続いて定量化され、したがって、エンドポイントアッセイ9、10、11、12、13、14、15、16、17、18 、19,20,21.他の人は、活性力を測定する非侵襲的な方法を可能にする培養システムを設計しているが、すべてが高内容分子試験用途7、8、9、10、14、18、22、23、24、25、26、27、28に適しているわけではない 、29.
このプロトコルは、骨格筋(Myo)のマイクロ組織配列 deviCe forCe (MyoTACTIC) プラットフォームでヒト筋肉微小組織 (hMMT) を作製する詳細な方法を説明します。3D骨格筋マイクロティッシュ30のバルク生産をサポートする96井戸プレート装置。MyoTACTICプレートの製造方法により、96ウェルポリジメチルシロキサン(PDMS)培養プレートと、対応するすべてのウェル機能を単一の鋳造工程で生成することができ、それによって各ウェルは、微小組織形成のために比較的少数の細胞を必要とする。MyoTACTIC内に形成されたマイクロ組織は、デバイスのウェルからウェルまで再現可能な整列、線条、および多核筋管を含み、成熟時に、その場で化学的および電気的刺激に応答することができる30。本明細書において、ポリウレタン(PU)レプリカからPDMS MyoTACTIC培養プレート装置を製造する技術、hMMTを作製するヒト不死化ヒト前駆細胞を導入するための最適化された方法、及び、工学的hMMT力生成およびカルシウム処理特性の機能評価について概説及び議論する。
Protocol
1. PDMS ミオタクティクプレート製作 注:PDMS MyoTACTICプレートの製造には、前に説明した30のように製造することができるPU負の金型が必要です。MyoTACTICプレートデザイン用のコンピュータ支援設計(CAD)SolidWorksファイルは、GitHub(https://github.com/gilbertlabcode/MyoTACTIC-SolidWork-CAD-file)で利用可能になりました。 シリコンエラストマーキットの成分を用いたモ?…
Representative Results
本明細書で説明する方法は、PU型から96ウェルPDMSベースのミオタクティブ培養プラットフォームをキャストし、hMMT複製組織の配列を作製し、培養装置力生成およびカルシウム処理におけるhMMT関数の2つの側面を分析する方法である。図1は、hMMTシード処理前のMyoTACTIC培養井戸の調製の概略図を示す。PDMSは、広く使用されているシリコーン系ポリマーであり、複雑なデバ?…
Discussion
本稿では、基本的な筋生物学、疾患モデリング、または候補分子検査の研究に適用できる3D hMMT培養モデルを作成し、分析する方法について説明します。MyoTACTICプラットフォームはコストに優しく、製造が容易で、骨格筋マイクロ組織を生成するために比較的少数の細胞を必要とします。MyoTACTIC培養プラットフォーム内で形成されたhMMTは、整列、多核、および線条筋のミオチューブから構成?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは、モハマド・アフシャール、ハーベン・アブラハ、モフセン・アフシャル・バクーシュリ、およびサデグ・ダブーディがMyoTACTIC文化プラットフォームの発明に貢献し、ここに記載されている捏造および分析方法を確立してくれたことに感謝します。HLは、オルガン・オン・チップ・エンジニアリング・アンド・アントレプレナーシップ奨学金の自然科学・工学研究評議会(NSERC)トレーニング・プログラムとトロント大学ワイルドキャット大学院奨学金から資金を受け取りました。PMGは内因性修復のカナダ研究委員長であり、オンタリオ州再生医療研究所、幹細胞ネットワーク、カナダ第一研究優秀プログラムである医学によるデザインからの研究の支援を受けています。スケマティック ダイアグラムは、BioRender.com を使用して作成されました。
Materials
| 0.9% Saline Solution, Sterile | House Brand | 1010 | 10 mL aliquots of the solution are made and stored at 4°C |
| 25G Needle | BD, Medstore, University of Toronto | 2548-CABD305127 | |
| 6-Aminocaproic Acid, ≥99% (titration), Powder | Sigma – Aldrich | A2504-100G | A 50 mg / mL stock solution is generated by dissolving 5 mg of 6-aminocaproic acid powder in 100 mL of autoclaved, distilled water. The solution is vaccum filtered and 10 mL aliquots are stored at 4°C |
| 6.35 mm ID Tubing | VWR | 60985-528 | |
| AB1167 Myoblast Cell Line | Institut de Myologie (Paris, France) | ||
| Arbitrary Waveform Generator | Rigol | DG1022Z | |
| Basement Membrane Extract (Geltrex) | Thermo Fisher Scientific | A14132-02 | Stored as aliquots of 50 µL or 100 µL at -80°C |
| Benchtop Vacuum Chamber | Sigma – Aldrich | D2672 | |
| BNC to Aligator Clip Cable | Ordered from Amazon | ||
| Culture Plastics | Sarstedt | Includes culture plates, serological pipettes, etc | |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma – Aldrich | D8418-250ML | |
| DPBS, Powder, No Calcium, No Magnesium | Thermo Fisher Scientific | 21600069 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (1X) | Gibco | 11995-065 | This is a high glucose DMEM with L-glutamine and sodium pyruvate |
| Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | 10437028 | |
| Fibrinogen from Bovine Plasma | Sigma – Aldrich | F8630-5G | Aliquots ranging from 7 – 10 mg of fibrinogen powder are made and stored at -20°C |
| Filtropur Syringe Filter, 0.22um Pore Size | Sarstedt | 83.1826.001 | |
| Horse Serum | Gibco | 16050-122 | |
| Human Recombinant Insulin | Sigma – Aldrich | 91077C | Stock solution is 100X and made by dissolving 1 mg of human recombinant insulin in 1 mL of DMEM and 1 µL of NaOH 10N. Solution is filtered and stored as 1 mL aliquots at 4°C |
| Image Acquisition Software | Olympus | cellSens Dimension | |
| Image Processing Software | National Institutes of Health | ImageJ | |
| Isotemp Oven | Thermo Fisher Scientific | 201 | |
| Microscope | Olympus | IX83 | |
| Microscope – Camera Mount | Labcam | Labcam for iPhone | Ordered from Amazon |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140-122 | |
| Plastic Disposable Syringes, 1cc | BD | 2606-309659 | |
| Plastic Disposable Syringes, 50cc | BD | 2612-309653 | |
| Pluronic F-127, Powder, BioReagent | Sigma – Aldrich | P2443-250G | A 5% stock solution of pluronic acid is made by dissolving 5 g of pluronic acid powder in 100 mL of chilled, autoclaved, distilled water. The solution is vaccum filtered and 10 mL aliquots are stored at 4°C |
| Polydimethylsiloxane (Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit) | Dow | 4019862 | Kits are also available at Thermo Fisher Scientific, Sigma – Aldrich, etc. |
| Polyurethane Negative Mold | In House | ||
| Release Agent | Mann Release Technologies | 200 | |
| Rotary Vane Vacuum Pump | Edwards | A65401906 | |
| Scalpel | Almedic, Medstore, University of Toronto | 2586-M36-0100 | |
| Single Edge Razor Blade | VWR | 55411-050 | |
| Skeletal Muscle Cell Basal Medium | Promocell | C-23260 | 30 mL aliquotes are generated and at stored at 4°C. |
| Skeletal Muscle Cell Growth Medium (Ready-to-use) | Promocell | C-23060 | 42 mL aliquots are generated and stored at 4°C. |
| Smartphone (iPhone) | Apple | SE | |
| Standard Duty Dry Vacuum Pump | Welch | 2546B-01 | |
| Sterilization Bag | Alliance | 211-SCM2 | |
| Thimble | Igege | Ordered from Amazon | |
| Thrombin from human plasma | Sigma – Aldrich | T6884-250UN | 100 units of thrombin is dissolved in 1 mL of a 0.1% BSA solution. 10 µL aliquots are prepared and stored at – 20°C. |
| Tin coated copper wire | Arco | B8871K48 | Ordered from Amazon |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Scientific | 15250061 | |
| Trypsin-EDTA, 0.25% | Thermo FIsher Scientific | 25200072 | |
| Vacuum Chamber 2 | SP Bel-Art | F42027-0000 |
Referências
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Citar este artigo
Lad, H., Musgrave, B., Ebrahimi, M., Gilbert, P. M. Assessing Functional Metrics of Skeletal Muscle Health in Human Skeletal Muscle Microtissues. J. Vis. Exp. (168), e62307, doi:10.3791/62307 (2021).