인간 골격 근육 미세 조직에서 골격 근육 건강의 기능 메트릭 평가
Summary
이 원고는 수축력 및 칼슘 취급 분석을 포함하여 기능분석에서 3D 인간 골격 근 미세 조직 및 최소 침습 다운스트림의 배열을 생성하는 상세한 프로토콜을 설명합니다.
Abstract
골격 근의 체외 모델에서 3차원 (3D)은 골격 근육 개혁을 연구하고 실험 적 조작에 적합한 확장 가능한 형식으로 기능을 할 수있는 기회를 제공함에 따라 생체 의학 연구에서 귀중한 발전입니다. 3D 근육 배양 시스템은 과학자들이 인간 세포의 맥락에서 골격 근 ex vivo를 연구할 수 있게 해 주도록 하는 것이 바람직합니다. 체외 모델에서 3D는 성인 골격 근의 기본 조직 구조의 측면을 밀접하게 모방합니다. 그러나 보편적 인 응용 프로그램은 조작, 비용 및 사용자 친화적 인 플랫폼의 가용성에 의해 제한되며 상대적으로 많은 양의 인간 골격 근육 조직을 산출합니다. 또한, 골격 근은 많은 질병 상태에서 시간이 지남에 따라 손상되는 중요한 기능적 역할을 하기 때문에, 미세 조직 연구를 위한 실험 플랫폼은 최소침습칼슘 과도 및 수축력 측정이 플랫폼 자체 내에서 직접 수행될 수 있을 때 가장 실용적입니다. 본 프로토콜에서, ‘MyoTACTIC’로 알려진 96웰 플랫폼의 제조, 3D 인간 골격 근육 미세 조직(hMMTs)의 대량 생산이 설명된다. 또한, 시간이 지남에 따라 각 미세 조직의 골격 근육력 및 칼슘 처리의 반복적인 측정을 가능하게 하는 전기 자극의 최소 침습적 적용 방법을 보고한다.
Introduction
골격 근은 인체에서 가장 풍부한 조직 중 하나이며 운동, 열 항상성 및 신진 대사1과같은 주요 신체 기능을 지원합니다. 역사적으로, 동물 모델 및 2차원(2D) 세포 배양 시스템은 생물학적 과정및 질병 병인을 연구하고, 골격 근질환 의 치료에 약리학적 화합물을 테스트하는 데 사용되어왔다2,3. 동물 모델은 건강과 질병에 있는 골격 근육에 대한 우리의 지식을 크게 향상시켰지만, 그들의 번역 영향은 높은 비용, 윤리적 고려 사항 및 종 간 차이2,4에의해 방해되었습니다. 골격 근육을 연구하기 위해 인간 세포 기반 시스템으로 전환할 때, 2D 세포 배양 시스템은 단순성 때문에 유리합니다. 그러나 제한사항이 있습니다. 이 형식은 종종 신체5,6내에서 자연적으로 발생하는 세포 세포 및 세포 외 세포 매트릭스 상호 작용을 다시 수적으로 회수하지 못합니다. 지난 몇 년 동안, 3차원(3D) 골격 근 모델은 생리학적 및 병리학적으로 관련된 과정의 모델링을 허용함으로써 전체 동물 모델 및 종래의 2D 배양 시스템에 대한 강력한 대안으로 등장하였다7,8. 실제로, 연구의 과다 바이오 인공 3D 배양 포맷1에서인간의 골격 근육을 모델링하는 전략을보고했다. 이러한 연구의 많은 한 가지 제한은 활성 힘이 배양 플랫폼에서 근육 조직을 제거하고 힘 변환기에 부착한 후 정량화되어 있으며, 이는파괴적이고 따라서 종점 분석9,10,12,13,14,15,16,17,18로 봉사하는 것으로 제한된다. ,19,20,21. 다른 사람들은 활성력을 측정하는 비침습적 방법을 허용하는 배양 시스템을 설계했지만, 모두 고함량 분자 테스트 응용 프로그램7,8,9,10,14,18,22,23,24,25,26,27, 27, 28에적합합니다. ,29.
이 프로토콜은 골격 근육 (Myo) 마이크로 조직 배열 편차 대한 조사를 위해 인간 근육 미세 조직 (hMMTs)을 제조하는 상세한 방법을 설명 (MyoTACTIC) 플랫폼; 3D 골격 근 미세조직(30)의벌크 생산을 지원하는 96개의 웰 플레이트 장치. 근로전술 플레이트 제조 방법은 96개의 잘 된 폴리디메틸실록산(PDMS) 배양판과 모든 상응하는 음피성을 단일 주조 단계에서 가능하게 하며, 이에 따라 각각의 우물은 미세 조직 형성을 위해 상대적으로 적은 수의 세포가 필요하다. 근로전술 내에서 형성된 미세조직은 장치의 우물에서 잘 에서 재현할 수 있는 정렬, striated 및 다핵근구를 포함하고, 성숙시, 시투30에서화학 및 전기 자극에 반응할 수 있다. 본 명세서에서, 폴리우레탄(PU) 복제본으로부터 PDMS 근구배양판 장치를 제조하는 기술은, hMMT를 제조하기 위해 불멸의 인간 근생 전조세포를 구현하는 최적화된 방법, 그리고 엔지니어링된 hMMT 력 생성 및 칼슘 취급 특성의 기능적 평가를 설명하고 논의한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 원고는 기본 근육 생물학, 질병 모델링 또는 후보 분자 테스트에 적용할 수 있는 3D hMMT 배양 모델을 제조하고 분석하는 방법을 설명합니다. MyoTACTIC 플랫폼은 비용 친화적이고 제조가 용이하며 골격 근육 미세 조직을 생산하기 위해 상대적으로 적은 수의 세포가 필요합니다. 근로전술 배양 플랫폼 내에 형성된 hMMT는 정렬, 다핵, 및 축소된 심포우로 구성되며, 수축을 유발하는 칼슘 과도를 시동?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 모하마드 아프샤르, 하벤 아브라하, 모센 아프샤르-바쿠쉬리, 사데다부디에게 MyoTACTIC 문화 플랫폼의 발명에 기여하고 여기에 설명된 제조 및 분석 방법을 확립해 주셔서 감사합니다. HL은 오르간 온-칩 엔지니어링 및 기업가 정신 장학금 및 토론토 와일드캣 대학 졸업생 장학금의 자연 과학 및 공학 연구 위원회 (NSERC) 교육 프로그램에서 자금을 받았다. PMG는 내인성 수리에 있는 캐나다 연구 의자이고 재생 의학을 위한 온타리오 연구소, 줄기 세포 네트워크 및 디자인에 의하여 의학에서 이 연구 결과에 대한 지원을 수신했습니다, 캐나다 첫번째 연구 우수성 프로그램. 회로도 는 BioRender.com 함께 만들어졌습니다.
Materials
| 0.9% Saline Solution, Sterile | House Brand | 1010 | 10 mL aliquots of the solution are made and stored at 4°C |
| 25G Needle | BD, Medstore, University of Toronto | 2548-CABD305127 | |
| 6-Aminocaproic Acid, ≥99% (titration), Powder | Sigma – Aldrich | A2504-100G | A 50 mg / mL stock solution is generated by dissolving 5 mg of 6-aminocaproic acid powder in 100 mL of autoclaved, distilled water. The solution is vaccum filtered and 10 mL aliquots are stored at 4°C |
| 6.35 mm ID Tubing | VWR | 60985-528 | |
| AB1167 Myoblast Cell Line | Institut de Myologie (Paris, France) | ||
| Arbitrary Waveform Generator | Rigol | DG1022Z | |
| Basement Membrane Extract (Geltrex) | Thermo Fisher Scientific | A14132-02 | Stored as aliquots of 50 µL or 100 µL at -80°C |
| Benchtop Vacuum Chamber | Sigma – Aldrich | D2672 | |
| BNC to Aligator Clip Cable | Ordered from Amazon | ||
| Culture Plastics | Sarstedt | Includes culture plates, serological pipettes, etc | |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma – Aldrich | D8418-250ML | |
| DPBS, Powder, No Calcium, No Magnesium | Thermo Fisher Scientific | 21600069 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (1X) | Gibco | 11995-065 | This is a high glucose DMEM with L-glutamine and sodium pyruvate |
| Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | 10437028 | |
| Fibrinogen from Bovine Plasma | Sigma – Aldrich | F8630-5G | Aliquots ranging from 7 – 10 mg of fibrinogen powder are made and stored at -20°C |
| Filtropur Syringe Filter, 0.22um Pore Size | Sarstedt | 83.1826.001 | |
| Horse Serum | Gibco | 16050-122 | |
| Human Recombinant Insulin | Sigma – Aldrich | 91077C | Stock solution is 100X and made by dissolving 1 mg of human recombinant insulin in 1 mL of DMEM and 1 µL of NaOH 10N. Solution is filtered and stored as 1 mL aliquots at 4°C |
| Image Acquisition Software | Olympus | cellSens Dimension | |
| Image Processing Software | National Institutes of Health | ImageJ | |
| Isotemp Oven | Thermo Fisher Scientific | 201 | |
| Microscope | Olympus | IX83 | |
| Microscope – Camera Mount | Labcam | Labcam for iPhone | Ordered from Amazon |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140-122 | |
| Plastic Disposable Syringes, 1cc | BD | 2606-309659 | |
| Plastic Disposable Syringes, 50cc | BD | 2612-309653 | |
| Pluronic F-127, Powder, BioReagent | Sigma – Aldrich | P2443-250G | A 5% stock solution of pluronic acid is made by dissolving 5 g of pluronic acid powder in 100 mL of chilled, autoclaved, distilled water. The solution is vaccum filtered and 10 mL aliquots are stored at 4°C |
| Polydimethylsiloxane (Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit) | Dow | 4019862 | Kits are also available at Thermo Fisher Scientific, Sigma – Aldrich, etc. |
| Polyurethane Negative Mold | In House | ||
| Release Agent | Mann Release Technologies | 200 | |
| Rotary Vane Vacuum Pump | Edwards | A65401906 | |
| Scalpel | Almedic, Medstore, University of Toronto | 2586-M36-0100 | |
| Single Edge Razor Blade | VWR | 55411-050 | |
| Skeletal Muscle Cell Basal Medium | Promocell | C-23260 | 30 mL aliquotes are generated and at stored at 4°C. |
| Skeletal Muscle Cell Growth Medium (Ready-to-use) | Promocell | C-23060 | 42 mL aliquots are generated and stored at 4°C. |
| Smartphone (iPhone) | Apple | SE | |
| Standard Duty Dry Vacuum Pump | Welch | 2546B-01 | |
| Sterilization Bag | Alliance | 211-SCM2 | |
| Thimble | Igege | Ordered from Amazon | |
| Thrombin from human plasma | Sigma – Aldrich | T6884-250UN | 100 units of thrombin is dissolved in 1 mL of a 0.1% BSA solution. 10 µL aliquots are prepared and stored at – 20°C. |
| Tin coated copper wire | Arco | B8871K48 | Ordered from Amazon |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Scientific | 15250061 | |
| Trypsin-EDTA, 0.25% | Thermo FIsher Scientific | 25200072 | |
| Vacuum Chamber 2 | SP Bel-Art | F42027-0000 |
Referências
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