Avaliação de métricas funcionais da saúde muscular esquelética em microtissues musculares esqueléticas humanas
Summary
Este manuscrito descreve um protocolo detalhado para produzir matrizes de microtissues musculares esqueléticos humanos 3D e minimamente invasivos a jusante em ensaios de função situ, incluindo força contraítil e análises de manuseio de cálcio.
Abstract
Modelos tridimensionais (3D) in vitro de músculo esquelético são um avanço valioso na pesquisa biomédica, pois oferecem a oportunidade de estudar a reforma muscular esquelética e funcionar em um formato escalável que é favorável a manipulações experimentais. Os sistemas de cultura muscular 3D são desejáveis, pois permitem que os cientistas estudem ex vivo muscular esquelético no contexto das células humanas. Modelos in vitro 3D imitam de perto aspectos da estrutura tecidual nativa do músculo esquelético adulto. No entanto, sua aplicação universal é limitada pela disponibilidade de plataformas simples de fabricar, custos e fáceis de usar, e produzem quantidades relativamente altas de tecidos musculares esqueléticos humanos. Além disso, uma vez que o músculo esquelético desempenha um importante papel funcional que é prejudicado ao longo do tempo em muitos estados da doença, uma plataforma experimental para estudos de microtissue é mais prática quando medidas minimamente invasivas de cálcio transitório e força contratil podem ser conduzidas diretamente dentro da própria plataforma. Neste protocolo, descreve-se a fabricação de uma plataforma de 96 poços conhecida como “MioTACTIC”, e a produção em massa de microtissues musculares esqueléticos 3D (hMMTs). Além disso, são relatados os métodos para uma aplicação minimamente invasiva de estimulação elétrica que permite medições repetidas da força muscular esquelética e do manuseio de cálcio de cada microtissue ao longo do tempo.
Introduction
O músculo esquelético é um dos tecidos mais abundantes no corpo humano e suporta funções fundamentais do corpo, como locomoção, homeostase de calor e metabolismo1. Historicamente, modelos animais e sistemas bidimensionais (2D) de cultura celular têm sido utilizados para estudar processos biológicos e patogênese de doenças, bem como para testar compostos farmacológicos no tratamento de doenças musculares esqueléticas2,3. Embora os modelos animais tenham melhorado muito nosso conhecimento sobre músculo esquelético em saúde e em doenças, seu impacto translacional tem sido dificultado por altos custos, considerações éticas e diferenças entre espécies2,4. Ao recorrer a sistemas baseados em células humanas para estudar músculo esquelético, os sistemas de cultura celular 2D são favoráveis devido à sua simplicidade. No entanto, há uma limitação. Esse formato muitas vezes não consegue recapitular as interações de células células e células-matriz extracelulares que ocorrem naturalmente dentro do corpo5,6. Ao longo dos últimos anos, modelos de músculos esqueléticos tridimensionais (3D) surgiram como uma alternativa poderosa aos modelos animais inteiros e sistemas convencionais de cultura 2D, permitindo a modelagem de processos fisiologicamente e patologicamente relevantes ex vivo7,8. De fato, uma infinidade de estudos têm relatado estratégias para modelar o músculo esquelético humano em um formato de cultura 3D bioartificial1. Uma limitação para muitos desses estudos é que a força ativa é quantificada após a remoção dos tecidos musculares das plataformas culturais e o apego a um transdutor de força, que é destrutivo e, portanto, limitado a servir como um ensaio de ponto final9,10,11,12,13,14,15,16,17,18 ,19,20,21. Outros projetaram sistemas culturais que permitem métodos não invasivos de medição da força ativa, mas nem todos são favoráveis a aplicações de teste de moléculas de alto conteúdo7,8,9,10,14,18,22,23,24,25,26,27,28 ,29.
Este protocolo descreve um método detalhado para fabricar microtissues musculares humanas (hMMTs) na plataforma microTissue Array deviCe To Investigate forCe (MyoTACTIC) do músculo esquelético (MyoTACTIC); um dispositivo de placa de 96 poços que suporta a produção em massa de microtissues musculares esqueléticas3D 30. O método de fabricação de placas mioTACTIC permite a geração de uma placa de cultura de polidimimetilaxitano (PDMS) de 96 poços e todas as características do poço correspondentes em uma única etapa de fundição, em que cada poço requer um número relativamente pequeno de células para formação de microtissue. Microtissues formados dentro do MioTACTIC contêm miótubos alinhados, estriados e multinucleados que são reprodutíveis do bem ao bem do dispositivo, e após a maturação, podem responder a estímulos químicos e elétricos no situ30. Aqui, a técnica de fabricação de um dispositivo de placa de cultura MyoTACTIC PDMS a partir de uma réplica de poliuretano (PU), um método otimizado para implementar células progenitoras miogênicas imortais para fabricar hMMTs, e a avaliação funcional das propriedades de geração de força hMMT e manuseio de cálcio são delineadas e discutidas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este manuscrito descreve métodos para fabricar e analisar um modelo de cultura 3D hMMT que pode ser aplicado a estudos de biologia muscular básica, modelagem de doenças ou para testes de moléculas de candidatos. A plataforma MyoTACTIC é amigável ao custo, fácil de fabricar, e requer um número relativamente pequeno de células para produzir microtissues musculares esqueléticas. os hMMTs formados dentro da plataforma de cultura MioTACTIC são compostos por miótubos alinhados, multinucleados e estriados, e respond…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gostaríamos de agradecer a Mohammad Afshar, Haben Abraha, Mohsen Afshar-Bakooshli e Sadegh Davoudi por contribuir para a invenção da plataforma de cultura MioTACTIC e estabelecer os métodos de fabricação e análise aqui descritos. A HL recebeu financiamento de um Programa de Treinamento do Conselho de Pesquisa em Ciências Naturais e Engenharia (NSERC) em Bolsa de Engenharia e Empreendedorismo de Órgãos e Empreendedorismo e de bolsas de pós-graduação da Universidade de Toronto Wildcat. PmG é a Cadeira de Pesquisa do Canadá em Reparação Endógena e recebeu apoio para este estudo do Instituto de Medicina Regenerativa de Ontário, da Rede de Células-Tronco e da Medicina por Design, um Programa de Excelência em Primeira Pesquisa do Canadá. Diagramas esquemáticos foram criados com BioRender.com.
Materials
| 0.9% Saline Solution, Sterile | House Brand | 1010 | 10 mL aliquots of the solution are made and stored at 4°C |
| 25G Needle | BD, Medstore, University of Toronto | 2548-CABD305127 | |
| 6-Aminocaproic Acid, ≥99% (titration), Powder | Sigma – Aldrich | A2504-100G | A 50 mg / mL stock solution is generated by dissolving 5 mg of 6-aminocaproic acid powder in 100 mL of autoclaved, distilled water. The solution is vaccum filtered and 10 mL aliquots are stored at 4°C |
| 6.35 mm ID Tubing | VWR | 60985-528 | |
| AB1167 Myoblast Cell Line | Institut de Myologie (Paris, France) | ||
| Arbitrary Waveform Generator | Rigol | DG1022Z | |
| Basement Membrane Extract (Geltrex) | Thermo Fisher Scientific | A14132-02 | Stored as aliquots of 50 µL or 100 µL at -80°C |
| Benchtop Vacuum Chamber | Sigma – Aldrich | D2672 | |
| BNC to Aligator Clip Cable | Ordered from Amazon | ||
| Culture Plastics | Sarstedt | Includes culture plates, serological pipettes, etc | |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma – Aldrich | D8418-250ML | |
| DPBS, Powder, No Calcium, No Magnesium | Thermo Fisher Scientific | 21600069 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (1X) | Gibco | 11995-065 | This is a high glucose DMEM with L-glutamine and sodium pyruvate |
| Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | 10437028 | |
| Fibrinogen from Bovine Plasma | Sigma – Aldrich | F8630-5G | Aliquots ranging from 7 – 10 mg of fibrinogen powder are made and stored at -20°C |
| Filtropur Syringe Filter, 0.22um Pore Size | Sarstedt | 83.1826.001 | |
| Horse Serum | Gibco | 16050-122 | |
| Human Recombinant Insulin | Sigma – Aldrich | 91077C | Stock solution is 100X and made by dissolving 1 mg of human recombinant insulin in 1 mL of DMEM and 1 µL of NaOH 10N. Solution is filtered and stored as 1 mL aliquots at 4°C |
| Image Acquisition Software | Olympus | cellSens Dimension | |
| Image Processing Software | National Institutes of Health | ImageJ | |
| Isotemp Oven | Thermo Fisher Scientific | 201 | |
| Microscope | Olympus | IX83 | |
| Microscope – Camera Mount | Labcam | Labcam for iPhone | Ordered from Amazon |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140-122 | |
| Plastic Disposable Syringes, 1cc | BD | 2606-309659 | |
| Plastic Disposable Syringes, 50cc | BD | 2612-309653 | |
| Pluronic F-127, Powder, BioReagent | Sigma – Aldrich | P2443-250G | A 5% stock solution of pluronic acid is made by dissolving 5 g of pluronic acid powder in 100 mL of chilled, autoclaved, distilled water. The solution is vaccum filtered and 10 mL aliquots are stored at 4°C |
| Polydimethylsiloxane (Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit) | Dow | 4019862 | Kits are also available at Thermo Fisher Scientific, Sigma – Aldrich, etc. |
| Polyurethane Negative Mold | In House | ||
| Release Agent | Mann Release Technologies | 200 | |
| Rotary Vane Vacuum Pump | Edwards | A65401906 | |
| Scalpel | Almedic, Medstore, University of Toronto | 2586-M36-0100 | |
| Single Edge Razor Blade | VWR | 55411-050 | |
| Skeletal Muscle Cell Basal Medium | Promocell | C-23260 | 30 mL aliquotes are generated and at stored at 4°C. |
| Skeletal Muscle Cell Growth Medium (Ready-to-use) | Promocell | C-23060 | 42 mL aliquots are generated and stored at 4°C. |
| Smartphone (iPhone) | Apple | SE | |
| Standard Duty Dry Vacuum Pump | Welch | 2546B-01 | |
| Sterilization Bag | Alliance | 211-SCM2 | |
| Thimble | Igege | Ordered from Amazon | |
| Thrombin from human plasma | Sigma – Aldrich | T6884-250UN | 100 units of thrombin is dissolved in 1 mL of a 0.1% BSA solution. 10 µL aliquots are prepared and stored at – 20°C. |
| Tin coated copper wire | Arco | B8871K48 | Ordered from Amazon |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Scientific | 15250061 | |
| Trypsin-EDTA, 0.25% | Thermo FIsher Scientific | 25200072 | |
| Vacuum Chamber 2 | SP Bel-Art | F42027-0000 |
Referências
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