İnsan İskelet Kas Mikrotissularında İskelet Kas Sağlığının Fonksiyonel Ölçümlerinin Değerlendirilmesi
Summary
Bu makalede, 3D insan iskelet kas mikrotleri dizileri ve kas gücü ve kalsiyum elleçleme analizleri de dahil olmak üzere minimal invaziv aşağı akış in situ fonksiyon tahlilleri üretmek için ayrıntılı bir protokol açıklanmaktadır.
Abstract
İskelet kasının üç boyutlu (3D) in vitro modelleri, iskelet kası reformunu inceleme ve deneysel manipülasyonlara uygun ölçeklenebilir bir formatta işlev bulma fırsatını sağladığı için biyomedikal araştırmalarda değerli bir ilerlemedir. 3D kas kültürü sistemleri, bilim adamlarının iskelet kası ex vivo’larını insan hücreleri bağlamında incelemelerini sağladığı için arzu edilir. 3D in vitro modeller, yetişkin iskelet kasının doğal doku yapısının yönlerini yakından taklit etti. Bununla birlikte, evrensel uygulamaları, üretimi basit, maliyetli ve kullanıcı dostu olan ve nispeten yüksek miktarlarda insan iskelet kası dokusu sağlayan platformların mevcudiyeti ile sınırlıdır. Ek olarak, iskelet kası birçok hastalık eyaletinde zamanla bozulan önemli bir fonksiyonel rol oynadığından, mikrotissue çalışmaları için deneysel bir platform, minimal invaziv kalsiyum geçici ve kontrtil kuvvet ölçümleri doğrudan platformun kendi içinde yapılabildiğinde en pratiktir. Bu protokolde, ‘MyoTACTIC’ olarak bilinen 96 kuyulu bir platformun imalatı ve 3D insan iskelet kas mikrotissuesinin (hMMTs) toplu üretimi açıklanmıştır. Ek olarak, iskelet kas kuvvetinin tekrarlanan ölçümlerini ve zaman içinde her mikrotissue’nin kalsiyum elleçlenmesini sağlayan elektriksel stimülasyonun minimal invaziv bir uygulaması için yöntemler bildirilmiştir.
Introduction
İskelet kası insan vücudundaki en bol dokulardan biridir ve lokomotion, ısı homeostazı ve metabolizma gibi temel vücut fonksiyonlarını destekler1. Tarihsel olarak, hayvan modelleri ve iki boyutlu (2D) hücre kültürü sistemleri biyolojik süreçleri ve hastalık patogenezini incelemek ve iskelet kas hastalıklarının tedavisinde farmakolojik bileşikleri test etmek için kullanılmıştır2,3. Hayvan modelleri sağlıkta ve hastalıkta iskelet kası bilgimizi büyük ölçüde geliştirmiş olsa da, çevirisel etkileri yüksek maliyetler, etik hususlar ve türler arası farklılıklar ile engellenmiştir2,4. İskelet kasını incelemek için insan hücre tabanlı sistemlere yönelen 2D hücre kültürü sistemleri, basitlikleri nedeniyle elverişlidir. Ancak, bir sınırlama vardır. Bu biçim genellikle vücut içinde doğal olarak meydana gelen hücre-hücre ve hücre dışı matris etkileşimlerini yeniden yakalayamaz5,6. Son birkaç yılda, üç boyutlu (3D) iskelet kası modelleri, fizyolojik ve patolojik olarak ilgili süreçlerin modellenebilmesine izin vererek tüm hayvan modellerine ve geleneksel 2D kültür sistemlerine güçlü bir alternatif olarak ortaya çıkmıştır ex vivo7,8. Gerçekten de, çok sayıda çalışma, insan iskelet kasını biyoartificial 3D kültür formatında modelleme stratejileri bildirmiş1. Bu çalışmaların birçoğu için bir sınırlama, aktif kuvvetin kas dokularının kültür platformlarından çıkarılması ve yıkıcı olan bir kuvvet dönüştürücüye bağlanmasının ardından ölçülmesidir, bu da bir uç nokta olarak hizmet etmekle sınırlıdır9,10,11,12,13,14,15,16,17,18 ,19,20,21. Diğerleri aktif kuvveti ölçmek için non-invaziv yöntemlere izin veren kültür sistemleri tasarladılar, ancak hepsi yüksek içerikli molekül test uygulamaları 7 ,8,9, 10,14,18,22,23,24,25,26,27,28’euygundeğil. ,29.
Bu protokol, iskelet kası (Myo) microTissue Array deviCe To Investigate forCe (MyoTACTIC) platformunda insan kas mikrotissues (hMMTs) imal etmek için ayrıntılı bir yöntem açıklar; 3D iskelet kas mikrotissues 30 toplu üretimini destekleyen bir96kuyu plakası cihazı. MyoTACTIC plaka imalat yöntemi, 96 kuyu polidimetilsiloksisan (PDMS) kültür plakasının ve buna karşılık gelen tüm kuyu özelliklerinin tek bir döküm adımında üretilmesini sağlar, böylece her kuyu mikrotissue oluşumu için nispeten az sayıda hücre gerektirir. MyoTACTIC içinde oluşan mikrotissues, cihazın iyisinden iyisine tekrarlanabilir hizalanmış, çizgili ve çok irtiküle edilmiş miyotütler içerir ve olgunlaşma üzerine, kimyasal ve elektrik uyaranlarına yerinde yanıt verebilir30. Burada, bir poliüretan (PU) replikasından PDMS MyoTACTIC kültür plakası cihazı üretme tekniği, hMMT’leri üretmek için ölümsüzleştirilmiş insan miyojenik progenitör hücrelerini uygulamak için optimize edilmiş bir yöntem ve mühendislik hMMT kuvveti üretimi ve kalsiyum işleme özelliklerinin fonksiyonel değerlendirmesi özetlenmiş ve tartışılmıştır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu makalede, temel kas biyolojisi, hastalık modellemesi veya aday molekül testi çalışmalarına uygulanabilecek bir 3D hMMT kültür modeli oluşturma ve analiz etme yöntemleri açıklanmaktadır. MyoTACTIC platformu maliyet dostudur, üretimi kolaydır ve iskelet kas mikrotizeleri üretmek için nispeten az sayıda hücre gerektirir. MyoTACTIC kültür platformunda oluşturulan hMMT’ler hizalanmış, çok noktalatılmış ve çizgili miyotüplerden oluşur ve kasılmayı tetikleyen kalsiyum geçicilerini başlatara…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Mohammad Afshar, Haben Abraha, Mohsen Afshar-Bakooshli ve Sadegh Davoudi’ye MyoTACTIC kültür platformunun icadına katkıda bulunduklarından ve burada açıklanan imalat ve analiz yöntemlerini kurdukları için teşekkür ederiz. HL, Organ-on-a-Chip Mühendislik ve Girişimcilik Bursu’nda Bir Doğa Bilimleri ve Mühendislik Araştırma Konseyi (NSERC) Eğitim Programı ve Toronto Wildcat Üniversitesi lisansüstü burslarından fon aldı. PMG, Endojen Onarımda Kanada Araştırma Başkanıdır ve bu çalışma için Ontario Rejeneratif Tıp Enstitüsü, Kök Hücre Ağı ve Kanada’nın İlk Araştırma Mükemmellik Programı olan Medicine by Design’dan destek almıştır. Şematik diyagramlar BioRender.com ile oluşturuldu.
Materials
| 0.9% Saline Solution, Sterile | House Brand | 1010 | 10 mL aliquots of the solution are made and stored at 4°C |
| 25G Needle | BD, Medstore, University of Toronto | 2548-CABD305127 | |
| 6-Aminocaproic Acid, ≥99% (titration), Powder | Sigma – Aldrich | A2504-100G | A 50 mg / mL stock solution is generated by dissolving 5 mg of 6-aminocaproic acid powder in 100 mL of autoclaved, distilled water. The solution is vaccum filtered and 10 mL aliquots are stored at 4°C |
| 6.35 mm ID Tubing | VWR | 60985-528 | |
| AB1167 Myoblast Cell Line | Institut de Myologie (Paris, France) | ||
| Arbitrary Waveform Generator | Rigol | DG1022Z | |
| Basement Membrane Extract (Geltrex) | Thermo Fisher Scientific | A14132-02 | Stored as aliquots of 50 µL or 100 µL at -80°C |
| Benchtop Vacuum Chamber | Sigma – Aldrich | D2672 | |
| BNC to Aligator Clip Cable | Ordered from Amazon | ||
| Culture Plastics | Sarstedt | Includes culture plates, serological pipettes, etc | |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma – Aldrich | D8418-250ML | |
| DPBS, Powder, No Calcium, No Magnesium | Thermo Fisher Scientific | 21600069 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (1X) | Gibco | 11995-065 | This is a high glucose DMEM with L-glutamine and sodium pyruvate |
| Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | 10437028 | |
| Fibrinogen from Bovine Plasma | Sigma – Aldrich | F8630-5G | Aliquots ranging from 7 – 10 mg of fibrinogen powder are made and stored at -20°C |
| Filtropur Syringe Filter, 0.22um Pore Size | Sarstedt | 83.1826.001 | |
| Horse Serum | Gibco | 16050-122 | |
| Human Recombinant Insulin | Sigma – Aldrich | 91077C | Stock solution is 100X and made by dissolving 1 mg of human recombinant insulin in 1 mL of DMEM and 1 µL of NaOH 10N. Solution is filtered and stored as 1 mL aliquots at 4°C |
| Image Acquisition Software | Olympus | cellSens Dimension | |
| Image Processing Software | National Institutes of Health | ImageJ | |
| Isotemp Oven | Thermo Fisher Scientific | 201 | |
| Microscope | Olympus | IX83 | |
| Microscope – Camera Mount | Labcam | Labcam for iPhone | Ordered from Amazon |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140-122 | |
| Plastic Disposable Syringes, 1cc | BD | 2606-309659 | |
| Plastic Disposable Syringes, 50cc | BD | 2612-309653 | |
| Pluronic F-127, Powder, BioReagent | Sigma – Aldrich | P2443-250G | A 5% stock solution of pluronic acid is made by dissolving 5 g of pluronic acid powder in 100 mL of chilled, autoclaved, distilled water. The solution is vaccum filtered and 10 mL aliquots are stored at 4°C |
| Polydimethylsiloxane (Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit) | Dow | 4019862 | Kits are also available at Thermo Fisher Scientific, Sigma – Aldrich, etc. |
| Polyurethane Negative Mold | In House | ||
| Release Agent | Mann Release Technologies | 200 | |
| Rotary Vane Vacuum Pump | Edwards | A65401906 | |
| Scalpel | Almedic, Medstore, University of Toronto | 2586-M36-0100 | |
| Single Edge Razor Blade | VWR | 55411-050 | |
| Skeletal Muscle Cell Basal Medium | Promocell | C-23260 | 30 mL aliquotes are generated and at stored at 4°C. |
| Skeletal Muscle Cell Growth Medium (Ready-to-use) | Promocell | C-23060 | 42 mL aliquots are generated and stored at 4°C. |
| Smartphone (iPhone) | Apple | SE | |
| Standard Duty Dry Vacuum Pump | Welch | 2546B-01 | |
| Sterilization Bag | Alliance | 211-SCM2 | |
| Thimble | Igege | Ordered from Amazon | |
| Thrombin from human plasma | Sigma – Aldrich | T6884-250UN | 100 units of thrombin is dissolved in 1 mL of a 0.1% BSA solution. 10 µL aliquots are prepared and stored at – 20°C. |
| Tin coated copper wire | Arco | B8871K48 | Ordered from Amazon |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Scientific | 15250061 | |
| Trypsin-EDTA, 0.25% | Thermo FIsher Scientific | 25200072 | |
| Vacuum Chamber 2 | SP Bel-Art | F42027-0000 |
Referências
- Frontera, W. R., Ochala, J. Skeletal Muscle: A brief review of structure and function. Calcified Tissue International. 96 (3), 183-195 (2015).
- McGreevy, J. W., Hakim, C. H., McIntosh, M. A., Duan, D. Animal models of Duchenne muscular dystrophy: From basic mechanisms to gene therapy. DMM Disease Models and Mechanisms. 8 (3), 195-213 (2015).
- Young, J., et al. MyoScreen, a high-throughput phenotypic screening platform enabling muscle drug discovery. SLAS Discovery. 23 (8), 790-806 (2018).
- DiMasi, J. A., Hansen, R. W., Grabowski, H. G. The price of innovation: New estimates of drug development costs. Journal of Health Economics. 22 (2), 151-185 (2003).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).
- Duval, K., et al. Modeling physiological events in 2D vs. 3D cell culture. Physiology. 32 (4), 266-277 (2017).
- Vandenburgh, H., et al. Drug-screening platform based on the contractility of tissue-engineered muscle. Muscle and Nerve. 37 (4), 438-447 (2008).
- Vandenburgh, H., et al. Automated drug screening with contractile muscle tissue engineered from dystrophic myoblasts. The FASEB Journal. 23 (10), 3325-3334 (2009).
- Kim, J. H., et al. 3D bioprinted human skeletal muscle constructs for muscle function restoration. Scientific Reports. 8 (1), 12307 (2018).
- Takahashi, H., Shimizu, T., Okano, T. Engineered human contractile myofiber sheets as a platform for studies of skeletal muscle physiology. Scientific Reports. 8 (1), 1-11 (2018).
- Afshar Bakooshli, M., et al. A 3D culture model of innervated human skeletal muscle enables studies of the adult neuromuscular junction. eLife. 8, 1-29 (2019).
- Madden, L., Juhas, M., Kraus, W. E., Truskey, G. A., Bursac, N. Bioengineered human myobundles mimic clinical responses of skeletal muscle to drugs. eLife. 2015 (4), 3-5 (2015).
- Urciuolo, A., et al. Engineering a 3D in vitro model of human skeletal muscle at the single fiber scale. PLoS One. 15 (5), 0232081 (2020).
- Cvetkovic, C., Rich, M. H., Raman, R., Kong, H., Bashir, R. A 3D-printed platform for modular neuromuscular motor units. Microsystems & Nanoengineering. 3 (1), 1-9 (2017).
- Shima, A., Morimoto, Y., Sweeney, H. L., Takeuchi, S. Three-dimensional contractile muscle tissue consisting of human skeletal myocyte cell line. Experimental Cell Research. 370 (1), 168-173 (2018).
- Capel, A. J., et al. Scalable 3D printed molds for human tissue engineered skeletal muscle. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 20 (2019).
- Gholobova, D., et al. Human tissue-engineered skeletal muscle: a novel 3D in vitro model for drug disposition and toxicity after intramuscular injection. Scientific Reports. 8 (1), 1-14 (2018).
- Osaki, T., Uzel, S. G. M., Kamm, R. D. Microphysiological 3D model of amyotrophic lateral sclerosis (ALS) from human iPS-derived muscle cells and optogenetic motor neurons. Science Advances. 4 (10), 5847 (2018).
- Rao, L., Qian, Y., Khodabukus, A., Ribar, T., Bursac, N. Engineering human pluripotent stem cells into a functional skeletal muscle tissue. Nature Communications. 9 (1), (2018).
- Maffioletti, S. M., et al. Three-dimensional human iPSC-derived artificial skeletal muscles model muscular dystrophies and enable multilineage tissue engineering. Cell Reports. 23 (3), 899-908 (2018).
- Chal, J., et al. Generation of human muscle fibers and satellite-like cells from human pluripotent stem cells in vitro. Nature Protocols. 11 (10), 1833-1850 (2016).
- Khodabukus, A., et al. Electrical stimulation increases hypertrophy and metabolic flux in tissue-engineered human skeletal muscle. Biomaterials. 198, 259-269 (2019).
- Nagashima, T., et al. In vitro model of human skeletal muscle tissues with contractility fabricated by immortalized human myogenic cells. Advanced Biosystems. , 2000121 (2020).
- Mills, R. J., et al. Development of a human skeletal micro muscle platform with pacing capabilities. Biomaterials. 198, 217-227 (2019).
- Legant, W. R., et al. Microfabricated tissue gauges to measure and manipulate forces from 3D microtissues. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (25), 10097-10102 (2009).
- Prüller, J., Mannhardt, I., Eschenhagen, T., Zammit, P. S., Figeac, N. Satellite cells delivered in their niche efficiently generate functional myotubes in three-dimensional cell culture. PLOS One. 13 (9), 0202574 (2018).
- Sakar, M. S., et al. Formation and optogenetic control of engineered 3D skeletal muscle bioactuators. Lab on a Chip. 12 (23), 4976-4985 (2012).
- Zhang, X., et al. A system to monitor statin-induced myopathy in individual engineered skeletal muscle myobundles. Lab on a Chip. 18 (18), 2787-2796 (2018).
- Rajabian, N., et al. Bioengineered skeletal muscle as a model of muscle aging and regeneration. Tissue Engineering Part A. 27 (1-2), 74-86 (2020).
- Afshar, M. E., et al. A 96-well culture platform enables longitudinal analyses of engineered human skeletal muscle microtissue strength. Scientific Reports. 10 (1), 6918 (2020).
- Mamchaoui, K., et al. Immortalized pathological human myoblasts: Towards a universal tool for the study of neuromuscular disorders. Skeletal Muscle. 1 (1), 34 (2011).
- Halldorsson, S., Lucumi, E., Gómez-Sjöberg, R., Fleming, R. M. T. Advantages and challenges of microfluidic cell culture in polydimethylsiloxane devices. Biosensors and Bioelectronics. 63, 218-231 (2015).
- Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Bakooshli, M. A., et al. A 3D model of human skeletal muscle innervated with stem cell-derived motor neurons enables epsilon-subunit targeted myasthenic syndrome studies. BioRxiv. , 275545 (2018).
- Vandenburgh, H. H., Karlisch, P., Farr, L. Maintenance of highly contractile tissue-cultured avian skeletal myotubes in collagen gel. Vitro Cellular & Developmental Biology. 24 (3), 166-174 (1988).
- Bell, E., Ivarsson, B., Merrill, C. Production of a tissue-like structure by contraction of collagen lattices by human fibroblasts of different proliferative potential in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (3), 1274-1278 (1979).
- Hinds, S., Bian, W., Dennis, R. G., Bursac, N. The role of extracellular matrix composition in structure and function of bioengineered skeletal muscle. Biomaterials. 32 (14), 3575-3583 (2011).
