Um fluxo de trabalho de triagem rápida para identificar terapia de combinação potencial para GBM usando células-tronco glioma derivadas do paciente

Resumo

As células-tronco de glioma (GSCs) são uma pequena fração de células cancerosas que desempenham papéis essenciais na iniciação do tumor, angiogênese e resistência a medicamentos no glioblastoma (GBM), o tumor cerebral primário mais prevalente e devastador. A presença de GSCs torna o GBM muito refratária para a maioria dos agentes alvos individuais, de modo que métodos de triagem de alto rendimento são necessários para identificar potenciais terapêuticas de combinação eficaz. O protocolo descreve um fluxo de trabalho simples para permitir uma triagem rápida para terapia de combinação potencial com interação sinérgica. As etapas gerais deste fluxo de trabalho consistem em estabelecer GSCs com marca de luciferase, preparar placas revestidas de matrigel, triagem combinada de medicamentos, analisar e validar os resultados.

Resumo

As células-tronco de glioma (GSCs) são uma pequena fração de células cancerosas que desempenham papéis essenciais na iniciação do tumor, angiogênese e resistência a medicamentos no glioblastoma (GBM), o tumor cerebral primário mais prevalente e devastador. A presença de GSCs torna o GBM muito refratária para a maioria dos agentes alvos individuais, de modo que métodos de triagem de alto rendimento são necessários para identificar potenciais terapêuticas de combinação eficaz. O protocolo descreve um fluxo de trabalho simples para permitir uma triagem rápida para terapia de combinação potencial com interação sinérgica. As etapas gerais deste fluxo de trabalho consistem em estabelecer GSCs com marca de luciferase, preparar placas revestidas de matrigel, triagem combinada de medicamentos, analisar e validar os resultados.

Introdução

Glioblastoma (GBM) é o tipo mais comum e agressivo de tumor cerebral primário. Atualmente, a sobrevida geral de pacientes com GBM que receberam tratamento máximo (uma combinação de cirurgia, quimioterapia e radioterapia) ainda é menor que 15 meses; por isso terapias novas e eficazes para GBM são urgentemente necessárias.

A presença de células-tronco de glioma (GSCs) no GBM constitui um desafio considerável para o tratamento convencional, uma vez que essas células-tronco desempenham papéis pivôs na manutenção do microambiente tumoral, resistência a medicamentos e recorrência do tumor¹. Portanto, direcionar GSCs pode s....

Protocolo

A amostra GBM foi adquirida de um paciente durante uma operação de rotina após obter o consentimento totalmente informado pelo comitê de ética em pesquisa humana do Primeiro Hospital Afiliado da Universidade Médica de Nanjing.

1. Isolamento e cultura de GSCs derivados do paciente

1. Coloque tecido glioblastoma ressecado cirurgicamente fresco em um tubo de centrífuga de 15 mL cheio de PBS estéril e armazene o tecido no gelo até uma nova operação.
2. Pique o tecido GBM em peças de aproximadamente 0,5 a 1 mm de diâmetro usando uma tesoura de dissecção e lave as amostras de tecido com meio basal neuronal para remover detritos celu....

Resultados

As células XG387 formaram neuroesferas no meio de cultura descrito na Tabela 1 em uma placa de cultura de 6 poços de apego ultra-baixa ou uma placa não revestida⁵ (Figura 1A). Primeiro, foi realizado um teste para verificar se a intensidade de biolumescência das células XG387-Luc era proporcional ao número celular. Como mostrado na Figura 1B,a intensidade da biolumescência aumentou proporcionalmente à densidade celular e .......

Discussão

No presente estudo, foi descrito um protocolo que pode ser aplicado para identificar uma potencial terapia de combinação para GBM usando GSCs derivados do paciente. Ao contrário do modelo métrico de sinergia/aditividade padrão, como os métodos Loewe, BLISS ou HSA, foi utilizado um fluxo de trabalho simples e rápido que não requer que um par de drogas seja combinado em múltiplas concentrações de forma fatorial completa como os métodos tradicionais. Neste fluxo de trabalho, o SI (índice de sensibilidade) que é originado de.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
B-27	Gibco	17504-044	50X
EGF	Gibco	PHG0313	20 ng/ml
FGF	Gibco	PHG0263	20 ng/ml
Gluta Max	Gibco	35050061	100X
Neurobasal	Gibco	21103049	1X
Penicilina-Estreptomicina	HyClone	SV30010	P: 10.000 unidades/ml        S:  10.000 ug / ml
de piruvato de sódio	Gibco	2088876	100 mM
Tabela 1. O  formulação  do GSC  meio de cultura completo.
ABT-737	MCE		Seletivo e BH3 mimético  Bcl-2,  Bcl-xL  e  Bcl-w  inibidor
Adavosertib (MK-1775)	MCE		Wee1  inibidor
Axitinib	MCE		Inibidor de tirosina quinase multi-alvo
AZD5991	MCE		Mcl-1  inibidor
A 83-01	MCE		Potente inibidor de TGF-β receptor tipo I  ALK5 quinase
CGP57380	Selleck		Potent  MNK1  inibidor
Dactolisib (BEZ235)	Selleck		Dual ATP-competitivo  PI3K  e  mTOR  inibidor
Dasatinib	MCE		Dual  Bcr-Abl e Src família tirosina quinase  inibidor
Erlotinib	MCE		EGFR  inibidor de tirosina quinase
Gefitinib	MCE		EGFR tirosina quinase  inibidor
Linifanib	MCE		Inibidor multialvo de  VEGFR  e  PDGFR  família
Masitinibe	MCE		Inibidor de  c-Kit
ML141	Selleck		Inibidor não competitivo de  Cdc42 GTPase
OSI-930	MCE		Inibidor multi-alvo de Kit, KDR e CSF-1R
Palbociclibe	MCE		seletivo  CDK4  e  CDK6  inibidor
SB 202190	MCE		Seletivo  p38 MAP quinase  inibidor
Brometo de sepantônio (YM-155)	MCE		Survivina  inibidor
TCS 359	Selleck		Potente inibidor FLT3
UMI-77	MCE		Seletivo  Mcl-1  inibidor
4-Hidroxitamoxifeno (Afimoxifeno)	Selleck		Seletivo  receptor de estrogênio (ER)  modulador
Tabela 2. As informações de 20 agentes direcionados usados na tela de teste. Todos esses são inibidores moleculares seletivos de alvo. O provedor, o nome e os destinos foram fornecidos na tabela.