Ett snabbt screeningarbetsflöde för att identifiera potentiell kombinationsterapi för GBM med hjälp av patientbaserade Glioma-stamceller

Summary

Gliom stamceller (GSCs) är en liten del av cancerceller som spelar väsentliga roller i tumörinitiering, angiogenes och läkemedelsresistens i glioblastom (GBM), den vanligaste och förödande primära hjärntumören. Förekomsten av GSCs gör GBM mycket eldfast för de flesta enskilda riktade agenter, så screeningmetoder med hög genomströmning krävs för att identifiera potentiella effektiva kombinationsterapier. Protokollet beskriver ett enkelt arbetsflöde för att möjliggöra snabb screening för potentiell kombinationsterapi med synergistisk interaktion. De allmänna stegen i detta arbetsflöde består i att upprätta luciferasmärkta GSCs, förbereda matrigelbelagda plattor, kombinera läkemedelsscreening, analysera och validera resultaten.

Abstract

Gliom stamceller (GSCs) är en liten del av cancerceller som spelar väsentliga roller i tumörinitiering, angiogenes och läkemedelsresistens i glioblastom (GBM), den vanligaste och förödande primära hjärntumören. Förekomsten av GSCs gör GBM mycket eldfast för de flesta enskilda riktade agenter, så screeningmetoder med hög genomströmning krävs för att identifiera potentiella effektiva kombinationsterapier. Protokollet beskriver ett enkelt arbetsflöde för att möjliggöra snabb screening för potentiell kombinationsterapi med synergistisk interaktion. De allmänna stegen i detta arbetsflöde består i att upprätta luciferasmärkta GSCs, förbereda matrigelbelagda plattor, kombinera läkemedelsscreening, analysera och validera resultaten.

Introduction

Glioblastoma (GBM) är den vanligaste och aggressiva typen av primär hjärntumör. För närvarande är den totala överlevnaden för GBM-patienter som fick maximal behandling (en kombination av kirurgi, kemoterapi och strålbehandling) fortfarande kortare än 15 månader; så nya och effektiva terapier för GBM är brådskande.

Förekomsten av gliom stamceller (GSCs) i GBM utgör en betydande utmaning för den konventionella behandlingen eftersom dessa stamliknande celler spelar pivot roller i underhållet av tumör microenvironment, läkemedelsresistens och tumör återkommande¹. Därför kan inriktning på GSCs vara en lovande strategi för GBM behandling². En stor nackdel för läkemedlets effekt i GBM är dock dess heterogenetiska natur, inklusive men inte begränsat till skillnaden i genetiska mutationer, blandade subtyper, epigenetisk reglering och tumörmikromiljö som gör dem mycket eldfasta för behandling. Efter många misslyckade kliniska prövningar insåg forskare och kliniska forskare att målinriktad behandling med en enda agent förmodligen inte helt kan kontrollera utvecklingen av mycket heterogena cancerformer som GBM. Noggrant utvalda läkemedelskombinationer har godkänts för deras effektivitet genom att synergistiskt förbättra effekten av varandra, vilket ger en lovande lösning för GBM-behandling.

Även om det finns många sätt att utvärdera läkemedelsinteraktionerna i en läkemedelskombination, såsom CI (Kombinationsindex), HSA (Högsta enskilda medel) och Bliss-värden, etc.^3,4, baseras dessa beräkningsmetoder vanligtvis på flera koncentrationskombinationer. Dessa metoder kan faktiskt ge bekräftande bedömning av läkemedelsinteraktion men kan vara mycket mödosamma om de tillämpas vid screening med hög genomströmning. För att förenkla processen utvecklades ett screeningarbetsflöde för att snabbt identifiera de potentiella läkemedelskombinationer som hämmar tillväxten av GSCs från kirurgiska tarmbiopsier av patienten GBM. Ett känslighetsindex (SI) som återspeglar skillnaden mellan den förväntade kombinerade effekten och den observerade kombinerade effekten infördes i denna metod för att kvantifiera synergiseringseffekten av varje läkemedel, så att de potentiella kandidaterna lätt kan identifieras av SI-rankningen. Under tiden visar detta protokoll en exempelskärm för att identifiera den potentiella kandidaten/kandidaterna som kan synergisera anti-gliom-effekten med temozolomid, första linjens kemoterapi för GBM-behandling, bland 20 små molekylära hämmare.

Protocol

GBM-exemplaret förvärvades från en patient under en rutinoperation efter att ha fått fullt informerat samtycke från human research ethics committee vid The First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University. 1. Isolering och odling av patientbaserade GSCs Placera färsk kirurgiskt rekterad glioblastomvävnad i ett 15 ml centrifugeringsrör fyllt med steril PBS och förvara vävnaden på is tills den är vidare. Hacka GBM-vävnaden i bitar med en diameter på cirka…

Representative Results

XG387-cellerna bildade neurosfärer i odlingsmediet som beskrivs i tabell 1 i en ultralåg fastsättningsredskap 6-brunns odlingsplatta eller en icke-belagdplatta 5 (Figur 1A). Först utfördes ett test för att kontrollera om bioluminscensintensiteten från XG387-Luc-cellerna var proportionell mot cellnumret. Som visas i figur 1Bökade bioluminensintensiteten proportionellt mot celltätheten och resulterade i en linjär …

Discussion

I den aktuella studien beskrevs ett protokoll som kan tillämpas för att identifiera potentiell kombinationsbehandling för GBM med patientbaserade GSCs. Till skillnad från standardsynergi/additivitetsmåttsmodellen som Loewe-, BLISS- eller HSA-metoder användes ett enkelt och snabbt arbetsflöde som inte kräver att ett läkemedelspar kombineras vid flera koncentrationer på ett fullständigt faktoriellt sätt som de traditionella metoderna. I detta arbetsflöde introducerades SI (känslighetsindex) som härstammar fr…

Materials

B-27	Gibco	17504-044	50X
EGF	Gibco	PHG0313	20 ng/ml
FGF	Gibco	PHG0263	20 ng/ml
Gluta Max	Gibco	35050061	100X
Neurobasal	Gibco	21103049	1X
Penicillin-Streptomycin	HyClone	SV30010	P: 10,000 units/ml     S:  10,000 ug/ml
Sodium Pyruvate	Gibco	2088876	100 mM
Table 1. The formulation of GSC complete culture medium.
ABT-737	MCE		Selective and BH3 mimetic Bcl-2, Bcl-xL and Bcl-w inhibitor
Adavosertib (MK-1775)	MCE		Wee1 inhibitor
Axitinib	MCE		Multi-targeted tyrosine kinase inhibitor
AZD5991	MCE		Mcl-1 inhibitor
A 83-01	MCE		Potent inhibitor of TGF-β type I receptor ALK5 kinase
CGP57380	Selleck		Potent MNK1 inhibitor
Dactolisib (BEZ235)	Selleck		Dual ATP-competitive PI3K and mTOR inhibitor
Dasatinib	MCE		Dual Bcr-Abl and Src family tyrosine kinase inhibitor
Erlotinib	MCE		EGFR tyrosine kinase inhibitor
Gefitinib	MCE		EGFR tyrosine kinase inhibitor
Linifanib	MCE		Multi-target inhibitor of VEGFR and PDGFR family
Masitinib	MCE		Inhibitor of c-Kit
ML141	Selleck		Non-competitive inhibitor of Cdc42 GTPase
OSI-930	MCE		Multi-target inhibitor of Kit, KDR and CSF-1R
Palbociclib	MCE		Selective CDK4 and CDK6 inhibitor
SB 202190	MCE		Selective p38 MAP kinase inhibitor
Sepantronium bromide (YM-155)	MCE		Survivin inhibitor
TCS 359	Selleck		Potent FLT3 inhibitor
UMI-77	MCE		Selective Mcl-1 inhibitor
4-Hydroxytamoxifen(Afimoxifene)	Selleck		Selective estrogen receptor (ER) modulator
Table 2. The information of 20 targeted agents used in the test screen. All of these are target selective small molecular inhibitors. The provider, name, and targets were given in the table.