Meningitik Escherichia Coli ile Enfekte Olan Nötrofillerde Reaktif Oksijen Türlerinin Gerçek Zamanlı Nicelemesi
Summary
Escherichia coli, yenidoğan Gram-negatif bakteriyel menenjitin önde gelen nedenidir. Bakteriyel enfeksiyon sırasında, nötrofiller tarafından üretilen reaktif oksijen türleri önemli bir bakterisidal rol oynar. Burada, menenjit E. coli’yeyanıt olarak nötrofillerdeki reaktif oksijen türlerini tespit etmek için bir yöntem sunuyoruz.
Abstract
Escherichia coli (E. coli) yenidoğan menenjite neden olan en yaygın Gram-negatif bakteridir. Kan-beyin bariyeri yoluyla bakteriyemi ve bakteriyel penetrasyon oluşumu E. coli menenjit gelişimi için vazgeçilmez adımlardır. Reaktif oksijen türleri (ROS), istila edilen patojenleri yok etmek için nötrofillerin başlıca bakterisidal mekanizmalarını temsil eder. Bu protokolde, meningitik E. coli ile enfekte olan nötrofillerde zamana bağımlı hücre içi ROS üretimi, gerçek zamanlı bir floresan mikro plaka okuyucusu tarafından tespit edilen floresan ROS probları kullanılarak ölçüldü. Bu yöntem, patojen konak etkileşimleri sırasında memeli hücrelerinde ROS üretiminin değerlendirilmesine de uygulanabilir.
Introduction
Yenidoğan bakteriyel menenjit yaygın bir pediatrik bulaşıcı hastalıktır. Bir K1 kapsülü ile Escherichia coli (E. coli), yenidoğan bakteriyel menenjite neden olan en yaygın Gram negatif patojendir ve toplam insidansin yaklaşık% 80’ini oluşturur1,2,3. Antimikrobiyal kemoterapi ve destekleyici bakımdaki gelişmelere rağmen, bakteriyel menenjit hala yüksek morbidite ve mortalite ile en yıkıcı durumlardan biridir4.
Yenidoğan bakteriyel menenjitin oluşumu genellikle patojenik bakterilerin yenidoğanların lokal lezyonlarından periferik dolaşıma girmesinden kaynaklanan bakteriyemi ile başlar, ardından kan-beyin bariyerinden (BBB) beyne nüfuz ederek menenjlerin iltihaplanmasına neden olur4. Bakteriseminin başlangıcı, nötrofiller ve makrofajlar vb. Beyaz kan hücrelerinin ~ 50-70% ‘ini oluşturan nötrofiller, bakteriyel enfeksiyonlara karşı ilk savunma hattıdır5,6. Bakterilerin istilası sırasında, aktif nötrofiller enfeksiyöz bölgelere alınır ve süperoksit anion, hidrojen peroksit, hidroksil radikalleri ve singlet oksijen7dahil olmak üzere reaktif oksijen türlerini (ROS) serbest bırakır. ROS hücre zarı, nükleik asit molekülleri ve bakteri proteinleri ile redoks reaksiyonlarına maruz kalan ve istilacı bakterilerin yaralanmasına ve ölümüne neden olan8. Mitokondri, ökaryotik hücrelerde ROS üretiminin ana alanıdır ve çeşitli oksidazlar (örneğin, nikotinamid adenin dinükleotid fosfat (NADPH) oksidaz kompleksi, lipoksijenaz sistemi, protein kinaz C ve siklooksijenaz sistemi) ROS9,10üretimine aracılık eder. Nötrofillerdeki birincil antimikrobiyal mekanizmayı temsil eden ROS üretiminin gerçek zamanlı ölçümü, bakteri-konak etkileşimi sırasında konak savunmasını incelemek için yararlı bir yöntemdir.
Bu protokolde, meningitik E. coli ile enfekte olan nötrofillerde zamana bağlı ROS üretimi, gerçek zamanlı bir floresan mikro plaka okuyucusu tarafından tespit edilen floresan ros probu DHE ile ölçüldü. Bu yöntem, patojen-konak etkileşimi sırasında diğer memeli hücrelerinde ROS üretiminin değerlendirilmesine de uygulanabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nötrofiller, insan kan dolaşımındaki beyaz kan hücrelerinin en bol bileşeni olarak işlev görür. Patojenlerin istilasına karşı ilk savunma hattını oluşturan doğuştan gelen insan bağışıklık sisteminde önemli efektör hücrelerdir11. ROS’un üretimi, fagositoz11’itakiben nötrofillerin önemli bakterisidal mekanizmalarından birini temsil eder. Son çalışmalar, nötrofil hücre dışı tuzak (NET) adı verilen bir nötrofil tarafından salınan net ben…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (31670845, 31870832, 32000811) ve Liaoning Eyaleti Seçkin Profesör Programı (LJH2018-35) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| 15 mL polypropylene conical centrifuge tubes | KIRGEN | KG2611 | |
| 96-well plate | Corning | 3025 | |
| Agar | DINGGUO | DH010-1.1 | |
| Autuomated cell counter | Bio-rad | 508BR03397 | |
| Biological Safety Carbinet | Shanghai Lishen | Hfsafe-1200Lcb2 | |
| Brain heart infusion | BD | 237500 | |
| CD16 Microbeads, human | Miltenyi Biotec | 130-045-701 | |
| Centrifuge | Changsha Xiangyi | TDZ5-WS | |
| Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| Dihydroethidium (DHE) | MedChemExpress | 104821-25-2 | |
| Fetal bovine serum | Cellmax | SA211.02 | |
| Incubator | Heraeus | Hera Cell | |
| MACS separation buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| Microplate Reader | Molecular Devices | SpectraMax M5 | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Beyoitme | S1819-1mg | |
| QuadroMACS separation Unit | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| Rifampicin | Solarbio | 13292-46-1 | |
| RPMI1640 medium | Sangon Biotech | E600027-0500 | |
| Thermostatic shaker | Shanghai Zhicheng | ZWY-100D | |
| Trypton | OXOID | LP0042 | |
| Yeast extract | OXOID | LP0021 |
References
- Kim, K. S. Acute bacterial meningitis in infants and children. Lancet Infectious Diseases. 10 (1), 11 (2010).
- Woll, C., et al. Epidemiology and Etiology of Invasive Bacterial Infection in Infants </=60 Days Old Treated in Emergency Departments. Journal of Pediatrics. 200, 210-217 (2018).
- Xu, M., et al. Etiology and Clinical Features of Full-Term Neonatal Bacterial Meningitis: A Multicenter Retrospective Cohort Study. Frontiers in Pediatrics. 7, 31 (2019).
- Kim, K. S. Human Meningitis-Associated Escherichia coli. EcoSal Plus. 7 (1), (2016).
- Rosales, C. Neutrophils at the crossroads of innate and adaptive immunity. Journal of Leukocyte Biology. 108 (1), 377-396 (2020).
- Kolaczkowska, E., Kubes, P. Neutrophil recruitment and function in health and inflammation. Nature Reviews: Immunology. 13 (3), 159-175 (2013).
- Winterbourn, C. C., Kettle, A. J., Hampton, M. B. Reactive Oxygen Species and Neutrophil Function. Annual Review of Biochemistry. 85, 765-792 (2016).
- Witko-Sarsat, V., Descamps-Latscha, B., Lesavre, P., Halbwachs-Mecarelli, L. Neutrophils: Molecules, Functions and Pathophysiological Aspects. Laboratory Investigation. 80 (5), 617-653 (2000).
- Zorov, D. B., Juhaszova, M., Sollott, S. J. Mitochondrial reactive oxygen species (ROS) and ROS-induced ROS release. Physiological Reviews. 94 (3), 909-950 (2014).
- Zeng, M. Y., Miralda, I., Armstrong, C. L., Uriarte, S. M., Bagaitkar, J. The roles of NADPH oxidase in modulating neutrophil effector responses. Molecular Oral Microbiology. 34 (2), 27-38 (2019).
- Liew, P. X., Kubes, P. The Neutrophil’s Role During Health and Disease. Physiological Reviews. 99 (2), 1223-1248 (2019).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil Extracellular Traps Kill Bacteria. Science. 303 (5), 1532-1535 (2004).
- Lam, G. Y., Huang, J., Brumell, J. H. The many roles of NOX2 NADPH oxidase-derived ROS in immunity. Seminars in Immunopathology. 32 (4), 415-430 (2010).
- Panday, A., Sahoo, M. K., Osorio, D., Batra, S. NADPH oxidases: an overview from structure to innate immunity-associated pathologies. Cellular & Molecular Immunology. 12 (1), 5-23 (2015).
- Nunes, P., Demaurex, N., Dinaue, C. Regulation of the NADPH Oxidase and Associated Ion Fluxes During Phagocytosis. Traffic. 14, 1118-1131 (2013).
- Dahlgren, C., Karlsson, A., Bylund, J. Intracellular Neutrophil Oxidants: From Laboratory Curiosity to Clinical Reality. Journal of Immunology. 202 (11), 3127-3134 (2019).
- Stoiber, W., Obermayer, A., Steinbacher, P., Krautgartner, W. D. The Role of Reactive Oxygen Species (ROS) in the Formation of Extracellular Traps (ETs) in Humans. Biomolecules. 5 (2), 702-723 (2015).
- Haynes, A. P., Fletcher, J. neutrophil function test. Clinical Haematology. 3 (4), 871-887 (1990).
- Eichelberger, K. R., Goldman, W. E. Human Neutrophil Isolation and Degranulation Responses to Yersinia pestis Infection. Methods in Molecular Biology. 2010, 197-209 (2019).
- Siano, B., Oh, H., Diamond, S. Neutrophil isolation protocol. Journal of Visualized Experiments. (17), (2008).
- Chen, X., Zhong, Z., Xu, Z., Chen, L., Wang, Y. 2′,7′-Dichlorodihydrofluorescein as a fluorescent probe for reactive oxygen species measurement: Forty years of application and controversy. Free Radical Research. 44 (6), 587-604 (2010).
- Woolley, J. F., Stanicka, J., Cotter, T. G. Recent advances in reactive oxygen species measurement in biological systems. Trends in Biochemical Sciences. 38 (11), 556-565 (2013).
- Dikalov, S. I., Harrison, D. G. Methods for detection of mitochondrial and cellular reactive oxygen species. Antioxidants and Redox Signaling. 20 (2), 372-382 (2014).
- Puleston, D. Detection of Mitochondrial Mass, Damage, and Reactive Oxygen Species by Flow Cytometry. Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (9), (2015).
