Bestemmelse af total lipid- og lipidklasser i marineprøver

Summary

Denne protokol er til bestemmelse af lipider i havvand og biologiske prøver. Lipider i filtrater ekstraheres med chloroform eller blandinger af chloroform og methanol i tilfælde af faste stoffer. Lipid klasser måles ved stang tynd-lag kromatografi med flamme ionisering afsløring og deres sum giver det samlede lipid indhold.

Abstract

Lipider består i vid udstrækning af kulstof og brint og giver derfor en større specifik energi end andre organiske makromolekyler i havet. At være kulstof- og brintrige er de også hydrofobiske og kan fungere som opløsningsmiddel og absorptionsbærer for organiske forurenende stoffer og kan således være drivkræfter for forurenende bioakkumulering i marine økosystemer. Deres hydrofobiske natur letter deres isolering fra havvand eller biologiske prøver: marine lipidanalyse begynder med prøveudtagning og derefter udvinding i ikke-polære organiske opløsningsmidler, hvilket giver en bekvem metode til deres adskillelse fra andre stoffer i en akvatisk matrix.

Hvis der er udtaget prøver af havvand, omfatter det første trin normalt adskillelse i operationelt definerede “opløste” og “partikelfraktioner” ved filtrering. Prøver indsamles og lipider isoleres fra prøvematrixen typisk med kloroform for virkelig opløst stof og kolloider og med blandinger af chloroform og methanol til faste stoffer og biologiske prøver. Sådanne ekstrakter kan indeholde flere klasser fra biogene og menneskeskabte kilder. På dette tidspunkt, samlede lipider og lipid klasser kan bestemmes. Total lipid kan måles ved at opsummere individuelt bestemte lipid klasser, som sædvanligvis er blevet kromatisk adskilt. Tyndt lag kromatografi (TLC) med flammeionisering detektion (FID) bruges regelmæssigt til kvantitativ analyse af lipider fra marine prøver. TLC-FID giver synoptisk lipid klasse information og, ved opsummering klasser, en total lipid måling.

Lipid klasse information er især nyttig, når de kombineres med målinger af individuelle komponenter, f.eks fedtsyrer og / eller steroler, efter deres frigivelse fra lipid ekstrakter. Den brede vifte af lipidstrukturer og -funktioner betyder, at de anvendes bredt i økologisk og biogeokemisk forskning, der vurderer økosystemets sundhed og graden af indflydelse fra menneskeskabte virkninger. De er blevet anvendt til at måle stoffer af kosten værdi for havfauna (f.eks. aquafeeds og/eller byttedyr) og som en indikator for vandkvaliteten (f.eks. kulbrinter).

Introduction

De metoder, der er beskrevet her, vedrører stoffer, der defineres operationelt som marine lipider. Denne definition er baseret på deres evne til væskevæskeudvinding i ikke-polære organiske opløsningsmidler, og den giver en bekvem metode til deres adskillelse fra andre stoffer i en akvatisk matrix. Deres hydrofobiske natur letter deres isolation fra havvand eller biologiske prøver samt deres berigelse og fjernelse af salte og proteiner.

Målingen af lipidindhold og dets sammensætning i marine organismer har været af stor interesse for fødevarenetøkologi, akvakultur ernæring og fødevarevidenskab i årtier. Lipider er universelle komponenter i levende organismer, der fungerer som væsentlige molekyler i cellemembraner, som vigtige kilder til biotilgængelig energi, der giver varmeisolering og opdrift og tjener som signalmolekyler. Selv om procedurerne for lipidbestemmelse på andre områder er blevet beskrevet godt, kræver deres anvendelse sammen med marineprøver almindeligvis modifikationer for at tilpasse sig feltforholdene samt til prøvetype¹.

For havvandsprøver kræver det første trin normalt adskillelse i de operationelt definerede “opløste” og »partikelfraktioner«, normalt ved filtrering (protokoltrin 1). Partikelfraktionen er det, der bevares af filteret, og størrelsen af porerne er vigtig for at definere cut-off². Ofte når vi prøver partikler, vil vi gerne relatere lipidkoncentrationer til de samlede massekoncentrationer, i hvilket tilfælde der skal udtages en separat, mindre prøve (f.eks. 10 mL) til dette formål (protokoltrin 1, bemærk). For at få en nøjagtig massebestemmelse er det vigtigt at tilføje ammoniumformat (35 g/L) i slutningen af filtreringen.

Havvandsfiltratet fra den større prøve skal udgøre mellem 250 mL og 1 L afhængigt af prøvetypen og udsættes for væskevæskeudvinding i en separatortragt (protokoltrin 2). Lipiders hydrofobiske karakter betyder, at de kan adskilles fra andre forbindelser ved ekstraktion i et ikkepolar opløsningsmiddel som chloroform. Et tolagssystem er skabt, hvor lipider partition i det organiske lag, mens vandopløselige komponenter forbliver i det vandige lag.

Partikelprøver på et filter eller biologiske prøver ekstraheres med en modificeret Folch et al. ekstraktion³, der også involverer chloroform (protokoltrin 3). Igen skabes et organisk / vandigt system, hvor lipider opdeles i den organiske fase, mens vandopløselige molekyler forbliver i den vandige fase, og proteiner udfældes. Faktisk bruger de fleste laboratorier for faste stoffer en vis variation af Folch et al. extraction^{3-proceduren,} der involverer chloroform og methanol. For filtre er det første skridt at homogenisere i 2 mL kloroform og 1 mL methanol.

Under udvindingen skal det sikres, at lipider beskyttes mod kemisk eller enzymatisk modifikation ved at opbevare prøver og opløsningsmidler på is for at reducere esterbinding hydrolyse eller kulstof-carbon dobbeltbindingsinoxidation. Væv og celle lipider er ganske godt beskyttet af naturlige antioxidanter og ved opdeling^4; Efter homogeniseringen af prøver kombineres celleindholdet dog, hvilket gør lipider mere tilbøjelige til at ændre sig, kemisk eller enzymatisk. Nogle lipider, såsom de fleste steroler, er meget stabile, mens andre, såsom dem, der indeholder flerumættede fedtsyrer, er mere modtagelige for kemisk oxidation. Andre, såsom steroler med konjugerede dobbeltbindinger, er tilbøjelige til oxidation katalyseret af lys⁵. Efter ekstraktioner er lipider meget mere modtagelige for kemisk oxidation, og prøver bør opbevares under en inert gas som nitrogen. En blid strøm af kvælstof vil også blive brugt til at koncentrere ekstrakter.

Efter koncentration ville lipider normalt blive kvantificeret i løs vægt, da de er en vigtig komponent i marine økosystemer, der giver en høj koncentration af energi, mere end det dobbelte af kJ / g af kulhydrater og proteiner. Uvægerligt vil de næste blive kvantificeret som individuelle komponenter: den omfattende analyse af lipider indebærer generelt adskillelse i enklere kategorier i henhold til deres kemiske karakter. Således indebærer en fuld analyse måling af samlede lipider, lipidklasser og individuelle forbindelser.

Total lipid kan bestemmes ved at tage summen af individuelt målte lipid klasser adskilt af kromatografi⁶. En marine lipid ekstrakt kan indeholde mere end et dusin klasser fra biogene og menneskeskabte kilder. Den brede vifte af lipid strukturer betyder meget information kan opnås ved at bestemme individuelle gruppering af strukturer. Lipid klasser individuelt, eller i visse grupper, er blevet brugt til at signalere tilstedeværelsen af visse typer af organismer, samt deres fysiologiske status og aktivitet². De er også blevet anvendt som en indikator for oprindelsen af organisk materiale, herunder opløst organisk materiale (DOM) samt hydrofobiske forurenende stoffer.

Triacylglycerols, fosfolipider og steroler er blandt de mere vigtige biogene lipidklasser. De to første er biokemisk beslægtede, da de har en glycerol rygrad, hvortil to eller tre fedtsyrer er esterificeret (figur 1). Triacylglyceroler er sammen med voksestere meget vigtige opbevaringsstoffer, mens andre fedtsyreholdige lipidklasser såsom diacylglyceroler, frie fedtsyrer og monoacylglyceroler generelt er mindre bestanddele. Frie fedtsyrer er til stede ved lavere koncentrationer i levende organismer, da de umættede kan være giftige⁷. Steroler (både i deres frie og esterificerede former) og fede alkoholer er også inkluderet blandt de mindre polære lipider, mens glycolipider og fosfolipider er polære lipider. Polar lipider har en hydrofil gruppe, som giver mulighed for dannelse af lipid bilayers findes i cellemembraner. Gratis steroler er også membran strukturelle komponenter, og når de tages i forhold til triacylglycerols de giver en tilstand eller ernæringsmæssige indeks (TAG : ST), som har været meget udbredt⁸. Når de tages i forhold til fosfolipider (ST : PL), kan de bruges til at indikere plantens følsomhed over for salt: højere værdier opretholder strukturel integritet og reducerer membranens permeabilitet⁹. Det inverse forhold (PL : ST) er blevet undersøgt i toskallet væv under temperaturtilpasning¹⁰.

Marine lipid klasser kan adskilles af tyndt lag kromatografi (TLC) på silica gel belagt stænger (Protokol trin 4) og derefter detekteres og kvantificeres ved flamme ionisering detektion (FID) i en automatisk FID scanner. TLC/FID er rutinemæssigt blevet brugt til marine prøver, da det hurtigt leverer synoptiske lipidklassedata fra små prøver og ved at tage summen af alle klasser, en værdi for total lipider. TLC/FID har været underkastet en kvalitetssikringsvurdering og blev fundet at opfylde de standarder, der kræves for konsekvent ekstern kalibrering, lave emner og præcis replikeringsanalyse¹¹. Variationskoefficienter (CV) eller relative standardafvigelser er omkring 10 %, og FID-scannerens samlede lipiddata er normalt omkring 90 % af dem, der opnås ved gravimetriske og andre metoder². Gravimetry giver højere samlede lipider sandsynligvis, fordi FID scanner måler kun ikke-flygtige forbindelser, og også som et resultat af mulig optagelse af ikke-lipid materiale i gravimetriske målinger.

Oplysningerne fra lipid klasse analyse er især nyttige, når de kombineres med bestemmelser af fedtsyrer som enkeltpersoner, eller steroler, eller de to i kombination. Det første skridt i retning af disse analyser omfatter frigivelse af alle komponent fedtsyrer sammen med steroler i lipid ekstrakter (protokol trin 5). Den brede vifte af lipidstrukturer og -funktioner betyder, at de har set bred anvendelse i økologiske og biogeokemiske undersøgelser, der vurderer økosystemets sundhed og i hvilket omfang de er blevet påvirket af menneskeskabte og terrestriske input. De er blevet anvendt til at måle biosyntese af stoffer af kosten værdi til marine fauna samt til at angive kvaliteten af vandprøver. Måling af lipider i sedimentkerneprøver hjælper med at vise sedimenternes følsomhed over for ændringer i menneskers arealanvendelse nær land-hav-margenen.

Det primære værktøj til at identificere og kvantificere individuelle lipidforbindelser har traditionelt været gaskromatografi (GC) med FID. Før analyse dog, disse forbindelser er gjort mere flygtige ved derivatization. Fedtsyrer frigives i nærværelse af en sur katalysator (H₂SO₄) fra acyl lipidklasser (Figur 1). I organisk kemi er acylgruppen (R-C=O) normalt afledt af en carboxylic syre (R-COOH). De er derefter re-esterified til fedtsyrer methyl estere (FAME), som giver bedre adskillelser på GC kolonner (Protokol trin 5).

Protocol

BEMÆRK: For at rengøre glasvarer, instrumenter og filtre til lipidanalyser skal de vaskes 3 gange med methanol efterfulgt af 3 vaskes med kloroform eller opvarme dem til 450 °C i mindst 8 timer. 1. Filtreringsprocedure for opløst havvand og partikellipider BEMÆRK: Den særlige del af interessen er operationelt defineret ved filtreringsproceduren. I dette tilfælde er porestørrelsen 1,2 μm. Sæt filtreringsmanifolden op uden filter, …

Representative Results

Som den hurtigst voksende fødevareproduktionssektor udvikler akvakulturen sig med hensyn til teknologiske innovationer og tilpasninger for at opfylde skiftende krav. En af disse er at mindske afhængigheden af fiskemel og fiskeolie, der stammer fra vilde kilder, og som leverer foderingredienser til mange akvakulturarter. Terrestriske planteolier undersøges som bæredygtige og økonomiske erstatninger for fiskeolie i aquafeeds, og leveren er et målvæv til analyse, fordi det er det primære sted for lipid metabolisme<s…

Discussion

Den hastighed, hvormed TLC-FID-systemet giver synoptisk lipidklasseinformation fra små prøver, gør TLC-FID til et muligt værktøj til screening af havprøver, før der iværksættes mere involverede analyseprocedurer. Sådanne analyser kræver normalt frigivelse af komponentforbindelser fra lipidekstrakter og derivatisering for at øge volatiliteten i tilfælde af gaskromatografi. TLC-FID kombineret med GC-FID har vist sig at være en stærk kombination for ekstrakter af fisk og skaldyr og andre fødevarer<sup class=…

Materials

15 ml vials	VWR	66009-560
1-hexadecanol	Sigma	258741-1G
1-Monopalmitoyl-rac-glycerol	Sigma	M1640-1g
2 ml vials	VWR	46610-722
25 mm glass fibre filters	Fisher	09 874 32A
2ml pipet bulbs	VWR	82024-554
47 mm glass fibre filters	Fisher	09 874 32
5 3/4" pipets	Fisher	1367820A
9" pipets	Fisher	1367820C
Acetone	VWR	CAAX0116-1
Agilent GC-FID 6890	Agilent
Calcium Chloride ANHS 500gm	VWR	CACX0160-1
Caps for 2 ml vials	VWR	46610-712
chloroform	VWR	CACX1054-1
Cholesteryl palmitate	Sigma	C6072-1G
Chromarod S5	Shell USA	3252
Dichloromethane	VWR	CADX0831-1
DL-a-phosphatidylcholine, dipalmotoyl	Sigma	P5911-1g
Ethyl Ether, ACS grade anhydr 4L	VWR	CAEX0190-4
Glyceryl tripalmitate	Sigma	T5888-100MG
Hamilton Syringe 702SNR 25µl	Sigma	58381
Helium	Air Liquide	A0492781
Hexane	VWR	CAHX0296-1
Hydrogen regulator	VWR	55850-484
Iatroscan MK6	Shell USA
Kimwipes	Fisher	066662
Medical Air	Air Liquide	A0464563
Medium nitrile gloves	Fisher	191301597C
Nitrile gloves L	VWR	CA82013-782
Nitrogen	Air Liquide	A0464775
Nitrogen Regulator	VWR	55850-474
Nonadecane	Sigma	74158-1G
Palmitic acid	Sigma	P0500-10G
Repeating dispenser	Sigma	20943
Sodium Bicarbonate 1kg	VWR	CA97062-460
Sodium Sulfate Anhy ACS 500gr	VWR	CA71008-804
Sulfuric acid	VWR	CASX1244-5
Teflon tape	Fisher	14610120
tissue master 125 115V w/7mm homogenator	OMNI International	TM125-115
TLC development tank	Shell USA	3201
UHP hydrogen	Air Liquide	A0492788
VWR solvent repippetter	VWR	82017-766
VWR timer Flashing LED 2 channel	VWR	89140-196
Zebron ZB-Wax GC column	Phenomenex	7HM-G013-11