Bestemmelse av totale lipid- og lipidklasser i marine prøver

Summary

Denne protokollen er for bestemmelse av lipider i sjøvann og biologiske prøver. Lipider i filtrater ekstraheres med kloroform eller blandinger av kloroform og metanol i tilfelle av faste stoffer. Lipidklasser måles ved stang tynnlagskromatografi med flammeioniseringsdeteksjon, og summen gir det totale lipidinnholdet.

Abstract

Lipider består i stor grad av karbon og hydrogen og gir derfor en større spesifikk energi enn andre organiske makromolekyler i havet. Å være karbon- og hydrogenrik de er også hydrofobe og kan fungere som et løsningsmiddel og absorpsjonsbærer for organiske forurensninger og kan dermed være drivere av forurensende bioakkumulering i marine økosystemer. Deres hydrofobe natur letter isolasjonen fra sjøvann eller biologiske prøver: marin lipidanalyse begynner med prøvetaking og deretter ekstraksjon i ikke-polare organiske løsningsmidler, noe som gir en praktisk metode for separasjon fra andre stoffer i en akvatisk matrise.

Hvis sjøvann er prøvet, innebærer det første trinnet vanligvis separasjon i operasjonelt definerte “oppløste” og “partikkelfraksjoner” ved filtrering. Prøver samles inn og lipider isoleres fra prøvematrisen vanligvis med kloroform for virkelig oppløst materiale og kolloider, og med blandinger av kloroform og metanol for faste stoffer og biologiske prøver. Slike ekstrakter kan inneholde flere klasser fra biogene og menneskeskapte kilder. På dette tidspunktet kan totale lipider og lipidklasser bestemmes. Total lipid kan måles ved å summere individuelt bestemte lipidklasser som vanligvis har blitt kromatografisk separert. Tynnlagskromatografi (TLC) med flammeioniseringsdeteksjon (FID) brukes regelmessig til kvantitativ analyse av lipider fra marine prøver. TLC-FID gir synoptisk lipidklasseinformasjon og, ved å summere klasser, en total lipidmåling.

Lipidklasseinformasjon er spesielt nyttig når den kombineres med målinger av individuelle komponenter, for eksempel fettsyrer og/eller steroler, etter at de er frigjort fra lipidekstrakter. Det store utvalget av lipidstrukturer og -funksjoner betyr at de brukes bredt i økologisk og biogeokjemisk forskning som vurderer økosystemhelsen og graden av påvirkning av menneskeskapte påvirkninger. De har blitt brukt til å måle stoffer av kostholdsverdi til marin fauna (f.eks. aquafeeds og/eller byttedyr), og som en indikator på vannkvalitet (f.eks. hydrokarboner).

Introduction

Metodene beskrevet her gjelder stoffer som er definert operasjonelt som marine lipider. Denne definisjonen er basert på deres egnethet til væske-væske ekstraksjon i ikke-polare organiske løsningsmidler, og det gir en praktisk metode for deres separasjon fra andre stoffer i en akvatisk matrise. Deres hydrofobe natur letter isolasjonen fra sjøvann eller biologiske prøver, samt deres berikelse, og fjerning av salter og proteiner.

Målingen av lipidinnhold og dens sammensetning i marine organismer har vært av stor interesse for matnettøkologi, akvakulturernæring og matvitenskap i flere tiår. Lipider er universelle komponenter i levende organismer, som fungerer som essensielle molekyler i cellemembraner, som store kilder til biotilgjengelig energi, gir termisk isolasjon og oppdrift, og fungerer som signalmolekyler. Selv om prosedyrer for lipidbestemmelse på andre felt er beskrevet godt, krever deres bruk med marine prøver vanligvis modifikasjon for å tilpasse seg feltforhold samt prøvetype¹.

For sjøvannsprøver krever det første trinnet vanligvis separasjon i de operasjonelt definerte “oppløste” og “partikkelfraksjonene”, normalt ved filtrering (protokolltrinn 1). Partikkelfraksjonen er det som beholdes av filteret, og størrelsen på porene er viktig for å definere avskjæringen². Ofte når vi tar prøver av svevestøv, vil vi gjerne relatere lipidkonsentrasjoner til totale massekonsentrasjoner, i så fall må en separat, mindre prøve (f.eks. 10 ml) tas for dette formålet (Protokoll trinn 1, merk). For å få en nøyaktig massebestemmelse er det viktig å legge til ammoniumformat (35 g / L) på slutten av filtreringen.

Sjøvannsfiltratet fra den større prøven skal utgjøre mellom 250 ml og 1 l avhengig av prøvetype og utsettes for væskevæskeutvinning i en separatortrakt (protokolltrinn 2). Lipidenes hydrofobe natur betyr at de kan skilles fra andre forbindelser ved ekstraksjon i et ikkepolært løsningsmiddel som kloroform. Et tolagssystem opprettes der lipider partisjonerer seg inn i det organiske laget mens vannløselige komponenter forblir i det vandige laget.

Partikkelprøver på et filter, eller biologiske prøver ekstraheres med en modifisert Folch et al. ekstraksjon³, som også involverer kloroform (protokolltrinn 3). Igjen opprettes et organisk / vandig system der lipider partisjonerer seg inn i den organiske fasen, mens vannløselige molekyler forblir i den vandige fasen, og proteiner utfelles. Faktisk, for faste stoffer, bruker de fleste laboratorier en viss variasjon av Folch et al. ekstraksjon^3-prosedyren som involverer kloroform og metanol. For filtre er det første trinnet å homogenisere i 2 ml kloroform og 1 ml metanol.

Under utvinning bør det tas hensyn til å beskytte lipider mot kjemisk eller enzymatisk modifikasjon, ved å holde prøver og løsningsmidler på is for å redusere esterbinding hydrolyse eller karbonkarbon dobbel binding oksidasjon. Vev og cellelipider er ganske godt beskyttet av naturlige antioksidanter og ved oppdeling⁴; Etter homogeniseringen av prøver kombineres imidlertid celleinnhold som gjør lipider mer avhendet til endring, kjemisk eller enzymatisk. Noen lipider, som de fleste steroler, er svært stabile, mens andre, som de som inneholder flerumettede fettsyrer, er mer utsatt for kjemisk oksidasjon. Andre, som steroler med konjugerte doble bindinger, er utsatt for oksidasjon katalysert av lys⁵. Etter ekstraksjoner er lipider mye mer utsatt for kjemisk oksidasjon, og prøver bør lagres under en inert gass som nitrogen. En mild strøm av nitrogen vil også bli brukt til å konsentrere ekstrakter.

Etter konsentrasjonen vil lipider normalt kvantifiseres i bulk, da de er en viktig komponent i marine økosystemer som gir en høy konsentrasjon av energi, mer enn dobbelt så mye kJ /g karbohydrater og proteiner. Alltid ville de neste bli kvantifisert som individuelle komponenter: Den omfattende analysen av lipider innebærer generelt separasjon i enklere kategorier, i henhold til deres kjemiske natur. Dermed innebærer en full analyse å måle totale lipider, lipidklasser og individuelle forbindelser.

Total lipid kan bestemmes ved å ta summen av individuelt målte lipidklasser atskilt med kromatografi⁶. Et marint lipidekstrakt kan inneholde mer enn et dusin klasser fra biogene og menneskeskapte kilder. Det brede utvalget av lipidstrukturer betyr at mye informasjon kan oppnås ved å bestemme individuelle grupperinger av strukturer. Lipidklasser individuelt, eller i visse grupper, har blitt brukt til å signalisere tilstedeværelse av visse typer organismer, samt deres fysiologiske status og aktivitet². De har også blitt brukt som en indikator på opprinnelsen til organisk materiale, inkludert oppløst organisk materiale (DOM) samt hydrofobe forurensninger.

Triacylglyseroler, fosfolipider og steroler er blant de viktigste biogene lipidklassene. De to første er biokjemisk relatert da de har en glyserol ryggrad som to eller tre fettsyrer er esterifisert (Figur 1). Triacylglyseroler, sammen med voksester, er svært viktige lagringsstoffer, mens andre fettsyreholdige lipidklasser som diacylglyseroler, frie fettsyrer og monoacylglyseroler generelt er mindre bestanddeler. Frie fettsyrer er tilstede ved lavere konsentrasjoner i levende organismer, da de umettede kan være giftige⁷. Steroler (både i frie og esterifiserte former) og fettalkoholer er også inkludert blant de mindre polare lipidene, mens glykolipider og fosfolipider er polare lipider. Polar lipider har en hydrofil gruppe, noe som gjør det mulig å danne lipidbilayere som finnes i cellemembraner. Frie steroler er også membranstrukturelle komponenter, og når de tas i forhold til triacylglyseroler, gir de en tilstand eller ernæringsmessig indeks (TAG : ST) som har blitt mye brukt⁸. Når de tas i forhold til fosfolipider (ST : PL), kan de brukes til å indikere plantefølsomhet for salt: høyere verdier opprettholder strukturell integritet og reduserer membrangjennomtrengelighet⁹. Det motsatte av dette forholdet (PL : ST) har blitt studert i bivalve vev under temperaturtilpasning¹⁰.

Marine lipidklasser kan separeres av tynnlagskromatografi (TLC) på silikagelbelagte stenger (protokolltrinn 4) og deretter oppdages og kvantifiseres ved flammeioniseringsdeteksjon (FID) i en automatisk FID-skanner. TLC/FID har rutinemessig blitt brukt til marine prøver, da det raskt gir synoptiske lipidklassedata fra små prøver, og ved å ta summen av alle klasser, en verdi for totale lipider. TLC/FID har blitt utsatt for en kvalitetssikringsvurdering (QA) og ble funnet å oppfylle standarder som kreves for konsistent ekstern kalibrering, lave emner og presis replikeringsanalyse¹¹. Variasjonskoeffisienter (CV) eller relative standardavvik er rundt 10 %, og de totale LIPID-dataene for FID-skanneren er normalt rundt 90 % av dem som oppnås ved gravimetrisk og andre metoder². Gravimetry gir høyere totale lipider sannsynligvis fordi FID-skanneren bare måler ikke-flyktige forbindelser, og også som et resultat av mulig inkludering av ikke-lipidmateriale i gravimetriske målinger.

Informasjonen fra lipidklasseanalyse er spesielt nyttig når den kombineres med bestemmelse av fettsyrer som individer, eller steroler, eller de to i kombinasjon. Det første skrittet mot disse analysene innebærer frigjøring av alle komponentfettsyrer sammen med steroler i lipidekstraktene (protokolltrinn 5). Det store utvalget av lipidstrukturer og -funksjoner betyr at de har sett bred bruk i økologiske og biogeokjemiske studier som vurderer økosystemhelsen og i hvilken grad de har blitt påvirket av menneskeskapte og terrestriske tilførsler. De har blitt brukt til å måle biosyntese av stoffer av kostholdsverdi til marin fauna, samt for å indikere kvaliteten på vannprøver. Måling av lipider i sedimentkjerneprøver bidrar til å vise sedimentenes følsomhet for endringer i menneskelig arealbruk nær landbunnsmarginen.

Det primære verktøyet for å identifisere og kvantifisere individuelle lipidforbindelser har tradisjonelt vært gasskromatografi (GC) med FID. Før analyse blir imidlertid disse forbindelsene gjort mer flyktige ved avledning. Fettsyrer frigjøres i nærvær av en sur katalysator_(H2SO₄) fra acyl lipidklasser (figur 1). I organisk kjemi er akrylgruppen (R-C = O) vanligvis avledet fra en karboksylsyre (R-COOH). De blir deretter re-esterified til fettsyre metyl estere (FAME) som gir bedre separasjoner på GC kolonner (Protocol trinn 5).

Protocol

MERK: For å rengjøre glass, instrumenter og filtre for lipidanalyser, vask dem 3 ganger med metanol etterfulgt av 3 vasker med kloroform, eller varm dem opp til 450 °C i minst 8 timer. 1. Filtreringsprosedyre for sjøvann oppløst og partikkellipider MERK: Den spesielle brøkdelen av interessen er operasjonelt definert av filtreringsprosedyren. I dette tilfellet er porestørrelsen 1,2 μm. Sett opp filtreringsmanifolden uten filter og s…

Representative Results

Som den raskest voksende matproduksjonssektoren utvikler havbruk seg når det gjelder teknologiske innovasjoner og tilpasninger for å møte endrede krav. En av disse er å redusere avhengigheten av villkornet fiskemel og fiskeolje, som gir fôringredienser til mange akvakulturarter. Jordbaserte planteoljer undersøkes som bærekraftige og økonomiske erstatninger for fiskeolje i aquafeeds, og leveren er et målvev for analyse fordi det er det primære stedet for lipidmetabolisme12. <strong class=…

Discussion

Hastigheten som TLC-FID-systemet gir synoptisk lipidklasseinformasjon fra små prøver, gjør TLC-FID til et dyktig verktøy for screening av marine prøver før det foretas mer involverte analytiske prosedyrer. Slike analyser krever vanligvis frigjøring av komponentforbindelser fra lipidekstrakter og avledning for å øke volatiliteten ved gasskromatografi. TLC-FID kombinert med GC-FID har vist seg å være en kraftig kombinasjon for ekstrakter av sjømat og andre matvarer¹⁴. For vellykkede mari…

Materials

15 ml vials	VWR	66009-560
1-hexadecanol	Sigma	258741-1G
1-Monopalmitoyl-rac-glycerol	Sigma	M1640-1g
2 ml vials	VWR	46610-722
25 mm glass fibre filters	Fisher	09 874 32A
2ml pipet bulbs	VWR	82024-554
47 mm glass fibre filters	Fisher	09 874 32
5 3/4" pipets	Fisher	1367820A
9" pipets	Fisher	1367820C
Acetone	VWR	CAAX0116-1
Agilent GC-FID 6890	Agilent
Calcium Chloride ANHS 500gm	VWR	CACX0160-1
Caps for 2 ml vials	VWR	46610-712
chloroform	VWR	CACX1054-1
Cholesteryl palmitate	Sigma	C6072-1G
Chromarod S5	Shell USA	3252
Dichloromethane	VWR	CADX0831-1
DL-a-phosphatidylcholine, dipalmotoyl	Sigma	P5911-1g
Ethyl Ether, ACS grade anhydr 4L	VWR	CAEX0190-4
Glyceryl tripalmitate	Sigma	T5888-100MG
Hamilton Syringe 702SNR 25µl	Sigma	58381
Helium	Air Liquide	A0492781
Hexane	VWR	CAHX0296-1
Hydrogen regulator	VWR	55850-484
Iatroscan MK6	Shell USA
Kimwipes	Fisher	066662
Medical Air	Air Liquide	A0464563
Medium nitrile gloves	Fisher	191301597C
Nitrile gloves L	VWR	CA82013-782
Nitrogen	Air Liquide	A0464775
Nitrogen Regulator	VWR	55850-474
Nonadecane	Sigma	74158-1G
Palmitic acid	Sigma	P0500-10G
Repeating dispenser	Sigma	20943
Sodium Bicarbonate 1kg	VWR	CA97062-460
Sodium Sulfate Anhy ACS 500gr	VWR	CA71008-804
Sulfuric acid	VWR	CASX1244-5
Teflon tape	Fisher	14610120
tissue master 125 115V w/7mm homogenator	OMNI International	TM125-115
TLC development tank	Shell USA	3201
UHP hydrogen	Air Liquide	A0492788
VWR solvent repippetter	VWR	82017-766
VWR timer Flashing LED 2 channel	VWR	89140-196
Zebron ZB-Wax GC column	Phenomenex	7HM-G013-11