Determinação de Aulas De Lipídios e Lipídios Totais em Amostras Marinhas
Summary
Este protocolo é para a determinação de lipídios na água do mar e espécimes biológicos. Lipídios em filtrados são extraídos com clorofórmio ou misturas de clorofórmio e metanol no caso de sólidos. As classes lipídicas são medidas pela cromatografia de camada fina da haste com detecção de ionização de chamas e sua soma dá o teor lipíduo total.
Abstract
Os lipídios são em grande parte compostos de carbono e hidrogênio e, portanto, fornecem uma energia específica maior do que outras macromoléculas orgânicas no mar. Por serem ricos em carbono e hidrogênio, eles também são hidrofóbicos e podem atuar como um portador de solvente e absorção de contaminantes orgânicos e, portanto, podem ser condutores de bioacumulação poluente em ecossistemas marinhos. Sua natureza hidrofóbica facilita seu isolamento da água do mar ou espécimes biológicos: a análise lipídica marinha começa com a amostragem e, em seguida, a extração em solventes orgânicos não polares, fornecendo um método conveniente para sua separação de outras substâncias em uma matriz aquática.
Se a água do mar foi amostrada, o primeiro passo geralmente envolve a separação em facções ‘dissolvidas’ e ‘partículas’ definidas operacionalmente por filtragem. Amostras são coletadas e lipídios isolados da matriz amostral tipicamente com clorofórmio para matéria verdadeiramente dissolvida e coloides, e com misturas de clorofórmio e metanol para sólidos e espécimes biológicos. Esses extratos podem conter várias classes de fontes biogênicas e antropogênicas. Neste momento, podem ser determinados lipídios totais e classes lipídicas. O lipídio total pode ser medido somando classes lipídicas individualmente determinadas que normalmente foram separadas cromatograficamente. A cromatografia de camada fina (TLC) com detecção de ionização de chamas (FID) é regularmente utilizada para a análise quantitativa de lipídios a partir de amostras marinhas. O TLC-FID fornece informações de classe lipídica sinóptica e, por meio de aulas de resumição, uma medição lipídica total.
As informações de classe lipídica são especialmente úteis quando combinadas com medidas de componentes individuais, por exemplo, ácidos graxos e/ou esteróis, após sua liberação de extratos lipídicos. A grande variedade de estruturas e funções lipídicas significa que elas são amplamente utilizadas em pesquisas ecológicas e biogeoquímicas que avaliam a saúde do ecossistema e o grau de influência por impactos antropogênicos. Eles têm sido empregados para medir substâncias de valor dietético à fauna marinha (por exemplo, aquafeeds e/ou presas), e como um indicador da qualidade da água (por exemplo, hidrocarbonetos).
Introduction
Os métodos aqui descritos dizem respeito a substâncias que são definidas operacionalmente como lipídios marinhos. Esta definição baseia-se em sua comodidade à extração líquido-líquido em solventes orgânicos não polares, e fornece um método conveniente para sua separação de outras substâncias em uma matriz aquática. Sua natureza hidrofóbica facilita seu isolamento da água do mar ou espécimes biológicos, bem como seu enriquecimento, e a remoção de sais e proteínas.
A medição do conteúdo lipídado e sua composição em organismos marinhos tem sido de grande interesse em ecologia alimentar, nutrição de aquicultura e ciência alimentar há décadas. Lipídios são componentes universais em organismos vivos, agindo como moléculas essenciais nas membranas celulares, como principais fontes de energia biodispondiária, fornecendo isolamento térmico e flutuação, e servindo como moléculas de sinalização. Embora os procedimentos para a determinação lipídica em outros campos tenham sido bem descritos, seu uso com amostras marinhas geralmente requer modificações para se adaptar às condições de campo, bem como ao tipo de amostra1.
Para amostras de água do mar, o primeiro passo geralmente requer a separação nas frações operacionalmente definidas de ‘dissolvido’ e ‘partículas’, normalmente por filtragem (Protocolo passo 1). A fração de partículas é o que é retido pelo filtro, e o tamanho dos poros é importante na definição do corte2. Muitas vezes, quando estamos amostrando material particulado, gostaríamos de relacionar concentrações lipídicas a concentrações totais de massa, nesse caso uma amostra separada, menor, (por exemplo, 10 mL) tem que ser tomada para este fim (Protocolo passo 1, nota). Para obter uma determinação de massa precisa é importante adicionar formato de amônio (35 g/L) no final da filtragem.
O filtrado de água do mar da amostra maior deve variar entre 250 mL e 1 L, dependendo do tipo de amostra e é submetido à extração líquido-líquido em um funil separador (Protocolo passo 2). A natureza hidrofóbica dos lipídios significa que eles podem ser separados de outros compostos por extração em um solvente não-polar, como clorofórmio. Um sistema de duas camadas é criado onde os lipídios se particionam na camada orgânica, enquanto os componentes solúveis em água permanecem na camada aquosa.
Amostras de partículas em um filtro, ou amostras biológicas são extraídas com uma extração folch et al.modificada 3,também envolvendo clorofórmio (Protocolo passo 3). Mais uma vez, um sistema orgânico/aquoso é criado no qual os lipídios se particionam para a fase orgânica, enquanto moléculas solúveis em água permanecem na fase aquosa, e as proteínas são precipitadas. De fato, para sólidos, a maioria dos laboratórios utiliza alguma variação do procedimento folch et al. extração3 envolvendo clorofórmio e metanol. Para filtros, o primeiro passo é homogeneizar em 2 mL de clorofórmio e 1 mL de metanol.
Durante a extração, deve-se tomar cuidado para proteger os lipídios de modificações químicas ou enzimáticas, mantendo amostras e solventes no gelo para reduzir a hidrólise da ligação éster ou a oxidação de ligação carbono-carbono. Tecidos e lipídios celulares são bastante bem protegidos por antioxidantes naturais e por compartimentação4; no entanto, após a homogeneização das amostras, o conteúdo celular é combinado tornando lipídios mais dispostos à alteração, quimicamente ou enzimaticamente. Alguns lipídios, como a maioria dos esteróis, são muito estáveis, enquanto outros, como os que contêm ácidos graxos poli-insaturados, são mais suscetíveis à oxidação química. Outros, como esteróis com ligações duplas conjugadas, são propensos à oxidação catalisada pela luz5. Após extrações, lipídios são muito mais suscetíveis à oxidação química, e as amostras devem ser armazenadas sob um gás inerte, como nitrogênio. Um fluxo suave de nitrogênio também seria usado para concentrar extratos.
Após a concentração, os lipídios seriam normalmente quantificados a granel, pois são um componente importante dos ecossistemas marinhos que proporcionam uma alta concentração de energia, mais que o dobro do kJ/g de carboidratos e proteínas. Invariavelmente, eles seriam quantificados em seguida como componentes individuais: a análise abrangente dos lipídios geralmente envolve a separação em categorias mais simples, de acordo com sua natureza química. Assim, uma análise completa envolve a medição de lipídios totais, classes lipídicas e compostos individuais.
O lipídio total pode ser determinado tomando a soma das classes lipídicas medidas individualmente separadas pela cromatografia6. Um extrato lipídeto marinho pode conter mais de uma dúzia de classes de fontes biogênicas e antropogênicas. A grande variedade de estruturas lipídicas significa que muita informação pode ser obtida determinando agrupamentos individuais de estruturas. As classes lipídicas individualmente, ou em certos grupos, têm sido utilizadas para sinalizar a presença de certos tipos de organismos, bem como seu estado fisiológico e atividade2. Eles também têm sido usados como um indicador das origens dos materiais orgânicos, incluindo matéria orgânica dissolvida (DOM), bem como contaminantes hidrofóbicos.
Triacilglycerols, fosfolipídios e esteróis estão entre as classes lipídicas biogênicas mais importantes. Os dois primeiros estão bioquimicamente relacionados, pois possuem uma espinha dorsal glicerol à qual dois ou três ácidos graxos são esterificados(Figura 1). Triacylglycerols, juntamente com ésteres de cera são substâncias de armazenamento muito importantes, enquanto outras classes lipídicas contendo ácidos graxos, como diacilicoglicerols, ácidos graxos livres e monoacírgicos são geralmente constituintes menores. Os ácidos graxos livres estão presentes em concentrações mais baixas em organismos vivos, pois os insaturados podem ser tóxicos7. Esteróis (tanto em suas formas livres quanto esterificadas) e álcoois gordurosos também estão incluídos entre os lipídios menos polares, enquanto glicólipídios e fosfolipídios são lipídios polares. Os lipídios polares têm um grupo hidrofílico, que permite a formação de bicamadas lipídicas encontradas em membranas celulares. Esteróis livres também são componentes estruturais de membrana, e quando tomados em relação aos triacylglices fornecem uma condição ou índice nutricional (TAG : ST) que tem sido amplamente utilizado8. Quando tomados em razão para fosfolipídios (ST : PL) podem ser usados para indicar sensibilidade da planta ao sal: valores mais elevados mantêm a integridade estrutural e diminuem a permeabilidade da membrana9. O inverso dessa razão (PL : ST) tem sido estudado em tecidos bivalve durante a adaptação da temperatura10.
As classes lipídicas marinhas podem ser separadas por cromatografia de camada fina (TLC) em hastes revestidas de gel de sílica (Protocolo passo 4) e, em seguida, detectadas e quantificadas pela detecção de ionização de chama (FID) em um scanner FID automático. O TLC/FID tornou-se rotineiramente usado para amostras marinhas, pois fornece rapidamente dados de classe lipídica sinóptica de pequenas amostras, e ao tomar a soma de todas as classes, um valor para lipídios totais. O TLC/FID foi submetido a uma avaliação de garantia de qualidade (QA) e foi encontrado para atender aos padrões necessários para calibração externa consistente, baixos espaços em branco e análise precisa de replicação11. Os coeficientes de variação (CV) ou desvios padrão relativos estão em torno de 10%, e os dados lipídicos totais do scanner FID são normalmente cerca de 90% daqueles obtidos por gravimétricos e outros métodos2. A gravimetria dá lipídios totais mais elevados provavelmente porque o scanner FID mede apenas compostos não voláteis, e também como resultado da possível inclusão de material não lipídico em medidas gravimétricas.
As informações fornecidas pela análise da classe lipídica são especialmente úteis quando combinadas com determinações de ácidos graxos como indivíduos, ou esteróis, ou os dois em combinação. O primeiro passo para essas análises envolve a liberação de todos os ácidos graxos componentes juntamente com esteróis nos extratos lipídicos (Protocolo passo 5). A grande variedade de estruturas e funções lipídicas significa que eles têm visto amplo uso em estudos ecológicos e biogeoquímicos que avaliam a saúde do ecossistema e até que ponto foram influenciados por insumos antropogênicos e terrestres. Eles têm sido usados para medir a biossíntese de substâncias de valor dietético para a fauna marinha, bem como para indicar a qualidade das amostras de água. Medir lipídios em amostras de núcleos de sedimentos ajuda a mostrar a sensibilidade dos sedimentos às mudanças no uso da terra humana perto da margem terrestre-marítima.
A principal ferramenta para identificar e quantificar compostos lipídicos individuais tem sido tradicionalmente cromatografia gasosa (GC) com FID. Antes da análise, porém, esses compostos são mais voláteis por derivatização. Os ácidos graxos são liberados na presença de um catalisador ácido (H2SO4) das classes lipídicas aciis(Figura 1). Em química orgânica, o grupo acil (R-C=O) é geralmente derivado de um ácido carboxílico (R-COOH). Eles são então reestrificados para ésteres de metila ácidos graxos (FAME) que dá melhores separações nas colunas GC (Protocolo passo 5).
Protocol
Representative Results
Discussion
A velocidade com que o sistema TLC-FID fornece informações de classe lipídica sinóptica de pequenas amostras torna o TLC-FID uma ferramenta capaz de triagem de amostras marinhas antes de realizar procedimentos analíticos mais envolvidos. Tais análises geralmente requerem a liberação de compostos componentes de extratos lipídes e derivação para aumentar a volatilidade no caso da cromatografia gasosa. O TLC-FID combinado com o GC-FID foi encontrado como uma combinação poderosa para extratos de frutos do mar e …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta pesquisa foi financiada pelo Conselho de Ciências Naturais e Pesquisa em Engenharia do Canadá (NSERC) 105379 para C.C. Parrish. A Rede de Treinamento de Equipamentos e Instrumentos De Pesquisa Core da Universidade Memorial (CREAIT) ajudou a financiar esta publicação.
Materials
| 15 ml vials | VWR | 66009-560 | |
| 1-hexadecanol | Sigma | 258741-1G | |
| 1-Monopalmitoyl-rac-glycerol | Sigma | M1640-1g | |
| 2 ml vials | VWR | 46610-722 | |
| 25 mm glass fibre filters | Fisher | 09 874 32A | |
| 2ml pipet bulbs | VWR | 82024-554 | |
| 47 mm glass fibre filters | Fisher | 09 874 32 | |
| 5 3/4" pipets | Fisher | 1367820A | |
| 9" pipets | Fisher | 1367820C | |
| Acetone | VWR | CAAX0116-1 | |
| Agilent GC-FID 6890 | Agilent | ||
| Calcium Chloride ANHS 500gm | VWR | CACX0160-1 | |
| Caps for 2 ml vials | VWR | 46610-712 | |
| chloroform | VWR | CACX1054-1 | |
| Cholesteryl palmitate | Sigma | C6072-1G | |
| Chromarod S5 | Shell USA | 3252 | |
| Dichloromethane | VWR | CADX0831-1 | |
| DL-a-phosphatidylcholine, dipalmotoyl | Sigma | P5911-1g | |
| Ethyl Ether, ACS grade anhydr 4L | VWR | CAEX0190-4 | |
| Glyceryl tripalmitate | Sigma | T5888-100MG | |
| Hamilton Syringe 702SNR 25µl | Sigma | 58381 | |
| Helium | Air Liquide | A0492781 | |
| Hexane | VWR | CAHX0296-1 | |
| Hydrogen regulator | VWR | 55850-484 | |
| Iatroscan MK6 | Shell USA | ||
| Kimwipes | Fisher | 066662 | |
| Medical Air | Air Liquide | A0464563 | |
| Medium nitrile gloves | Fisher | 191301597C | |
| Nitrile gloves L | VWR | CA82013-782 | |
| Nitrogen | Air Liquide | A0464775 | |
| Nitrogen Regulator | VWR | 55850-474 | |
| Nonadecane | Sigma | 74158-1G | |
| Palmitic acid | Sigma | P0500-10G | |
| Repeating dispenser | Sigma | 20943 | |
| Sodium Bicarbonate 1kg | VWR | CA97062-460 | |
| Sodium Sulfate Anhy ACS 500gr | VWR | CA71008-804 | |
| Sulfuric acid | VWR | CASX1244-5 | |
| Teflon tape | Fisher | 14610120 | |
| tissue master 125 115V w/7mm homogenator | OMNI International | TM125-115 | |
| TLC development tank | Shell USA | 3201 | |
| UHP hydrogen | Air Liquide | A0492788 | |
| VWR solvent repippetter | VWR | 82017-766 | |
| VWR timer Flashing LED 2 channel | VWR | 89140-196 | |
| Zebron ZB-Wax GC column | Phenomenex | 7HM-G013-11 |
Referências
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