Immunizzazione intranasale e raccolta del latte negli studi sull'immunizzazione materna nei conigli bianchi della Nuova Zelanda(Oryctolagus cuniculus)

Summary

Questo articolo descrive e dimostra la somministrazione di vaccini intranasali e la raccolta di latte dai conigli in allattamento (Oryctolagus cuniculus) come mezzo per valutare l’immunità mucosa in un modello traslazionale appropriato di immunizzazione materna.

Abstract

A causa delle somiglianze nella placentation e nel trasferimento di anticorpi con l’uomo, i conigli sono un eccellente modello di immunizzazione materna. Ulteriori vantaggi di questo modello di ricerca sono la facilità di allevamento e raccolta dei campioni, il periodo di gestazione relativamente breve e le grandi dimensioni dei rifiuti. Le vie comunemente valutate di immunizzazione includono sottocutanee, intramuscolari, intranasali e intradermiche. La raccolta non clinica dei campioni per l’individuazione cronologica delle risposte immunologiche a queste vaccinazioni include la raccolta di sangue, sia da dighe che da kit, e il latte proveniente dall’allattamento lo fa. In questo articolo, dimostreremo le tecniche che il nostro laboratorio ha utilizzato negli studi sull’immunizzazione materna nei conigli bianchi della NuovaZelanda (Oryctolagus cuniculus), inclusa l’immunizzazione intranasale e la raccolta del latte.

Introduction

Gli studi sull’immunizzazione materna e sul trasferimento di anticorpi sono inestimabili per numerose ragioni, poiché questa è la via iniziale di trasferimento dell’immunità e successiva protezione da agenti patogeni e malattie nei neonati e nei neonati. L’immunizzazione materna ha il potenziale di avere un impatto positivo sulla salute sia materna che infantile a livello globale riducendo la morbilità e la mortalità associate a determinati agenti patogeni durante questo periodo^{vulnerabile 1}. L’obiettivo principale di questa strategia è aumentare i livelli di anticorpi materni specifici durante la gravidanza. Questi anticorpi possono quindi essere trasferiti al neonato e al neonato a livelli sufficienti per proteggersi dalle infezioni fino a quando il loro sistema immunitario non è abbastanza maturo da rispondere^{adeguatamente alle sfide 1,2,3}. Lavori precedenti hanno dimostrato che i titolo di anticorpi più elevati alla nascita sono associati a una protezione completa o a un esordio ritardato e a una ridotta gravità di numerose diverse malattie infettive nel neonato, tra cui tetano, pertosse, virus respiratorio sinciziale (RSV), influenza e infezioni streptococciche di gruppo B^1,2,3.

Nell’uomo, gli anticorpi materni vengono trasferiti passivamente attraverso la placenta e vengono anche trasferiti attraverso il latte materno attraverso l’allattamento. Lavori precedenti hanno dimostrato che i livelli di IgA specifici per l’HIV nel latte materno umano delle madri infettate dal virus erano associati a una ridotta trasmissione postnatale del virus, suggerendo un ruolo protettivo per il latte materno anti-HIV IgA⁴. Studi su primati non umani hanno dimostrato che l’immunizzazione contro l’HIV può indurre una significativa risposta anticorpale nel latte materno, e sebbene risposte IgG siere simili siano state indotte a seguito dell’immunizzazione sistemica contro mucosa, l’immunizzazione mucosa ha indotto una risposta IgA significativamente^{più elevata all’interno del latte 5,6}.

L’individuazione di un modello animale trascrittariamente appropriato per tali studi dovrebbe tener conto del tipo di placentation e dei meccanismi di trasferimento passivo degli anticorpi, nonché del trasferimento di anticorpi attraverso il latte materno. Esistono tre tipi principali di placentazione nei mammiferi in base ai tipi e agli strati tissutali nell’interfaccia materno-fetale, tra cui emocorali (primati, roditori e conigli), endoteliocorali (carnivori) ed epiteliocorali (cavalli, maiali e ruminanti). La placenta emocorale è il tipo più invasivo, consentendo la comunicazione diretta tra l’apporto di sangue materno e il corione, o la membrana fetale più esterna. In base al numero di strati di trofoblasti, ci sono diverse variazioni di placentazione emocorale, tra cui la placenta emomonocorale che si trova nei primati, la placenta emodichoriale nei conigli e la placenta emotricorale osservata nei ratti e nei topi⁷. Questo contatto diretto tra l’apporto di sangue materno e il corione consente il trasferimento passivo di anticorpi attraverso la placenta durante la gestazione. IgG è l’unica classe di anticorpi che attraversa significativamente la placenta^{umana 8}, mentre L’IgA è la classe predominante di Ig che si trova nel latte materno^{umano 9}. Dei modelli scientificamente rilevanti, solo primati (compresi gli esseri umani), conigli e cavie trasferiscono IgG in utero e IgA nel latte^10,11. Pertanto, il modello del coniglio incorpora fattori paragonabili a quelli dell’uomo che controllano il trasferimento transplacentale dell’IgG e il trasferimento lattazionale dell’IgA.

Oltre a servire come modello eccezionale per l’immunità materna e lo sviluppo del vaccino, le somiglianze tra il coniglio e le cavità nasali umane li rendono un modello appropriato per l’immunizzazione intranasale. Il volume della cavità nasale del coniglio è più simile agli esseri umani rispetto ai modelli di roditori basati sulla massa corporea^{relativa 12}. Inoltre, Casteleyn et ^al. Il NALT si trova principalmente all’aspetto ventrale e ventromediale del meato nasale ventrale e all’aspetto laterale e dorsolaterale del meato nasofaringeo nei conigli, mentre nei roditori, il tessuto linfoide è presente solo lungo l’aspetto ventrale del meato nasofaringeo¹². Nei conigli, la struttura e la posizione dei linfociti intraepiteliali e lamina propria, così come i follicoli linfoidi isolati, sono simili agli esseri^{umani 12}.

Ulteriori vantaggi dell’uso del coniglio come modello per l’immunità materna e mucosa includono la loro elevata fecondità e il periodo di gestazione relativamente breve. I grandi vasi sanguigni auricolari consentono un accesso relativamente facile a grandi volumi di sangue per le raccolte seriali. Una varietà di campioni di mucosa può essere raccolta per test di risposta anticorpale specifici dell’antigene, compreso il latte^{materno 13} (in allattamento), le secrezioni o lavaggi della mucosa (ad esempio,^{orale 14,15,16}, lavanda broncoalsolare^{13,17,18,19,vaginale 20,21,22)}e le feci^20,23,24,25. I campioni di latte possono essere facilmente raccolti durante l’allattamento per valutare la presenza di risposte anticorpali specifiche dell’antigene. Sebbene non sia abbondante come per gli esseri umani e i topi, un’ampia varietà di reagenti sperimentali sono disponibili per studi e saggi specifici per conigli. In questo articolo, descriveremo e dimostreremo l’immunizzazione intranasale e la raccolta del latte nei conigli bianchi della Nuova Zelanda(Oryctolagus cuniculus).

Protocol

Tutte le procedure sono state approvate ed eseguite in conformità con le politiche della Duke University IACUC. NOTA: I materiali necessari sono forniti nella tabella dei materiali. 1. Sedazione del coniglio e anestesia Sedare il coniglio femmina (sessualmente maturo; circa 5-30 mesi) somministrando acepromazina per via intramuscolare (IM) a una dose di 1 mg/kg. A seconda delle dimensioni dell’animale, utilizzare una siringa da 1 o 3 ml c…

Representative Results

Una panoramica di un tipico progetto di studio di immunizzazione intranasale materna è descritta nella figura 1, che incorpora le immunizzazioni, l’allevamento, l’adessimento, l’allattamento e il trasferimento di anticorpi. Sebbene non sia illustrato, il sangue deve essere raccolto prima dell’immunizzazione iniziale per le misurazioni di base e per tutto il resto dello studio a intervalli regolari. Il sangue si ottiene facilmente attraverso l’arteria dell’orecchio centrale con sedazione lie…

Discussion

Sebbene non descritto nel protocollo precedente, l’allevamento riuscito dei conigli è necessario per questo modello materno e per consentire la raccolta del latte. I conigli sono facilmente allevati dalla copertura dal vivo in un ambiente di ricerca. Si raccomanda di trasferire nella gabbia del dollaro per l’allevamento, così come può essere territoriale e aggressivo se tenuto nella propria gabbia con il dollaro. Se le femmine non sono ricettive dopo 15 minuti (come indicato scappando mordendo o vocalizzando), la coni…

Materials

Intranasal Immunization
Anesthesia Machine/Vaporizer	Vet Equip	901807
Hypodermic Needle (25 g)	Terumo	07-806-7584
Isoflurane (250 mL Bottle)	Patterson Veterinary	07-893-1389	2-4%
Luer Lock Syringe (1 mL)	Air-Tite	07-892-7410
Mucosal Vaccine	N/A	N/A	Experimental Vaccine
Nose Cone	McCulloch Medical	07891-1097
Pipette Tips	VWR	53503-290
Pipettor	VWR	89079-962
PromAce (Acepromazine maleate)	Boehringer Ingelheim	07-893-5734	1mg/kg IM
Puralube Sterile Ophthalmic Ointment	Dechra	07-888-2572
Milk Collection
Alcohol Prep 2-ply	Covidien	07-839-8871
Anesthesia Machine/Vaporizer	Vet Equip	901807
Hypodermic Needles (25 g)	Terumo	07-806-7584
Isoflurane (250 mL Bottle)	Patterson Veterinary	07-893-1389	2-4%
Luer Lock Syringe (1 mL)	Air-Tite	07-892-7410
Non-Woven Sponge (4×4)	Covidien	07-891-5815
Nose Cone	McCulloch Medical	07891-1097
PromAce (Acepromazine Maleate)	Boehringer Ingelheim	07-893-5734	1mg/kg IM
Puralube Sterile Ophthalmic Ointment	Dechra	07-888-2572
Sterile Conical Vial (15 mL)	Falcon	14-959-49B