पॉलीएक्रेलैमाइड जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस और सिल्वर स्टेनिंग द्वारा ग्लाइकोसामिनोग्लाइकैन का पता लगाना
Summary
इस रिपोर्ट में जैविक नमूनों से सल्फसेटेड ग्लाइकोसामिनोग्लिकन (जीएजी) को अलग और शुद्ध करने की तकनीकों का वर्णन किया गया है और उनके आकार के अनुमानित करने के लिए एक पॉलीएक्रीलामाइड जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस दृष्टिकोण है। GAGs ऊतक संरचना में योगदान और प्रोटीन के साथ इलेक्ट्रोस्टैटिक बातचीत के माध्यम से संकेत प्रक्रियाओं को प्रभावित करते हैं । गैग बहुलक लंबाई कॉग्नेट लिगांड के लिए उनकी बाध्यकारी आत्मीयता में योगदान देती है।
Abstract
सल्फेट ग्लाइकोसिनोग्लिकन (जीजीएस) जैसे हेपरन सल्फेट (एचएस) और कोंड्रोइटिन सल्फेट (सीएस) जीवित जीवों में सर्वव्यापी हैं और विभिन्न प्रकार की बुनियादी जैविक संरचनाओं और प्रक्रियाओं में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। पॉलिमर के रूप में, GAGs पॉलीसैकराइड चेन युक्त पॉलीडिस्परज़ मिश्रण के रूप में मौजूद है जो 4000 डीए से लेकर 40,000 डीए से अधिक हो सकता है। इन श्रृंखलाओं के भीतर सल्फेट के डोमेन मौजूद हैं, जो नकारात्मक आवेश का एक पैटर्न प्रदान करते हैं जो कॉग्नेट प्रोटीन लिगांड के सकारात्मक आवेशित अवशेषों के साथ बातचीत की सुविधा प्रदान करता है। इन इलेक्ट्रोस्टैटिक इंटरैक्शन के लिए अनुमति देने के लिए जीएजी के सल्फेटेड डोमेन पर्याप्त लंबाई के होने चाहिए। जैविक ऊतकों में GAGs के कार्य को समझने के लिए, अन्वेषक को GAGs के आकार को अलग करने, शुद्ध करने और मापने में सक्षम होना चाहिए। यह रिपोर्ट एक व्यावहारिक और बहुमुखी पॉलीएक्रीलामाइड जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस आधारित तकनीक का वर्णन करती है जिसे विभिन्न जैविक ऊतक प्रकारों से अलग GAGs के बीच आकार में अपेक्षाकृत छोटे मतभेदों को हल करने के लिए लीवरेज किया जा सकता है।
Introduction
ग्लाइकोसमिनोग्लाइकन (जीएजी) रैखिक पॉलीसैकराइड्स का एक विविध परिवार है जो जीवित जीवों में एक सर्वव्यापी तत्व हैं और कई बुनियादी शारीरिक प्रक्रियाओं में योगदान देते हैं1। हेपरन सल्फेट (एचएस) और कोंड्रोइटिन सल्फेट (सीएस) जैसे जीएजी को पॉलीसैकराइड चेन के साथ अलग-अलग पदों पर सल्फस किया जा सकता है, जो नकारात्मक शुल्क के भौगोलिक डोमेन प्रदान करता है। ये जीएजी, जब प्रोटेओग्लाइकैन के रूप में जाने जाने वाले सेल-सरफेस प्रोटीन के लिए सीमित होते हैं, तो एक्साइटेसेलर स्पेस में प्रोजेक्ट करते हैं और कॉग्नेट लिगांड के लिए बाध्य करते हैं, दोनों सीआईएस के नियमन के लिए अनुमति देते हैं- (एक ही सेल से जुड़ी लिगांड) और ट्रांस-(पड़ोसी सेल से जुड़ी लिगामेंट) सिग्नलिंगप्रक्रियाएं 2। इसके अलावा, जीजीएस ऊतकों में संरचनात्मक तत्वों जैसे ग्लोमेरुलर बेसमेंट झिल्ली3, संवहनी एंडोथेलियल ग्लाइकोलिक्स 4 और पल्मोनरी एपिथेलियल ग्लाइकोलिक्स5 और कनेक्टिव ऊतकों में ऐसे उपास्थि6जैसे महत्वपूर्ण भूमिकाएं भी करते हैं।
गैग पॉलीसैकराइड चेन की लंबाई इसके जैविक संदर्भ के अनुसार काफी भिन्न होती है और इसे अत्यधिक जटिल एंजाइमेटिक नियामक प्रणाली7द्वारा गतिशील रूप से लंबा, क्लीव्ड और संशोधित किया जा सकता है। महत्वपूर्ण बात यह है कि गैग बहुलक श्रृंखलाओं की लंबाई लिगामेंट्स के लिए उनके बाध्यकारी आत्मीयता में काफी योगदान देती है और बाद में, उनके जैविक कार्य8,9में योगदान देती है। इस कारण से, एक अंतर्जात गैग के कार्य के निर्धारण के लिए इसके आकार की सराहना की आवश्यकता होती है। दुर्भाग्य से, प्रोटीन और न्यूक्लिक एसिड के विपरीत, बहुत कम आसानी से उपलब्ध तकनीकों का पता लगाने और GAGs, जो ऐतिहासिक रूप से इस विविध पॉलीसैकराइड परिवार की जैविक भूमिकाओं में अपेक्षाकृत सीमित जांच के परिणामस्वरूप है उपाय मौजूद हैं ।
यह लेख सबसे जैविक ऊतकों से जीएजी को अलग और शुद्ध करने का वर्णन करता है, और यह भी बताता है कि विशिष्टता की उचित डिग्री के साथ अलग-थलग पॉलिमर की लंबाई का मूल्यांकन करने के लिए पॉलीएक्रीलामाइड जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस (पेज) का उपयोग कैसे किया जाए। अन्य, अत्यधिक जटिल (और अक्सर बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री-आधारित) ग्लाइकोमिक दृष्टिकोणों के विपरीत, इस विधि को मानक प्रयोगशाला उपकरणों और तकनीकों का उपयोग करके नियोजित किया जा सकता है। इसलिए, यह व्यावहारिक दृष्टिकोण, देशी GAGs की जैविक भूमिका और प्रासंगिक रूप से महत्वपूर्ण ligands के साथ उनकी बातचीत का निर्धारण करने के लिए जांचकर्ताओं की क्षमता का विस्तार कर सकता है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
GAGs कई विविध जैविक प्रक्रियाओं में एक केंद्रीय भूमिका निभाते हैं । सल्फेटेड जीओजी (जैसे एचएस और सीएस) के प्रमुख कार्यों में से एक लिगांड के साथ बातचीत करना और बांधना है, जो डाउनस्ट्रीम सिग्नलिंग कार्यों …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को F31 HL143873-01 (WBL), R01 HL125371 (आरजेएल और ईपीएस) द्वारा वित्त पोषित किया गया था
Materials
| Accuspin Micro17 benchtop microcentrifuge | thermoFisher Scientific | 13-100-675 | Any benchtop microcentrifuge/rotor combination capable of 14000 xG is appropriate |
| Acrylamide (solid) | thermoFisher Scientific | BP170-100 | Electrophoresis grade |
| Actinase E | Sigma Aldrich | P5147 | Protease mix from S. griseus |
| Alcian Blue 8GX (solid) | thermoFisher Scientific | AC400460100 | |
| Ammonium acetate (solid) | thermoFisher Scientific | A639-500 | Molecular biology grade |
| Ammonium hydroxide (liquid) | thermoFisher Scientific | A669S-500 | certified ACS |
| Ammonium persulfate (solid) | thermoFisher Scientific | BP179-25 | electrophoresis grade |
| Barnstead GenPure Pro Water Purification System | ThermoFisher Scientific | 10-451-217PKG | Any water deionizing/ purification system is an acceptable substitute |
| Boric acid (solid) | thermoFisher Scientific | A73-500 | Molecular biology grade |
| Bromphenol blue (solid) | thermoFisher Scientific | B392-5 | |
| Calcium acetate (solid) | ThermoFisher Scientific | 18-609-432 | Molecular biology grade |
| Calcium chloride (solid) | ThermoFisher Scientific | AC349610250 | Molecular biology grade |
| CHAPS detergent (3-((3-cholamidopropyl) dimethylammonio)-1-propanesulfonate) | ThermoFisher Scientific | 28299 | |
| Chondroitinase ABC | Sigma Aldrich | C3667 | |
| Criterion empty cassette for PAGE (1.0mm thick, 12+2 wells) | Bio-Rad | 3459901 | Any 1.0mm thick PAGE casting cassette system will suffice |
| Criterion PAGE Cell system (cell and power supply) | Bio-Rad | 1656019 | any comparable vertical gel PAGE system will work) |
| Dichloromethane (liquid) | thermoFisher Scientific | AC610931000 | certified ACS |
| EDTA disodium salt (solid) | thermoFisher Scientific | 02-002-786 | Molecular biology grade |
| Glacial acetic acid (liquid) | thermoFisher Scientific | A35-500 | Certified ACS |
| Glycine (solid) | thermoFisher Scientific | G48-500 | Electrophoresis grade |
| Heparanase I/III | Sigma Aldrich | H3917 | From Flavobacterium heparinum |
| Heparin derived decasaccharide (dp10) | galen scientific | HO10 | |
| Heparin derived hexasaccharde (dp6) | Galen scientific | HO06 | |
| Heparin derived oligosaccharide (dp20) | galen scientific | HO20 | |
| Hydrochloric acid (liquid) | thermoFisher Scientific | A466-250 | |
| Lyophilizer | Labconco | 7752020 | Any lyophilizer that can achieve -40C and 0.135 Torr will work; can also be replaced with rotational vacuum concentrator |
| Methanol (liquid) | thermoFisher Scientific | A412-500 | Certified ACS |
| Molecular Imager Gel Doc XR System | Bio-Rad | 170-8170 | Any comparable gel imaging system is an acceptable substitute |
| N,N'-methylene-bis-acrylamide (solid) | thermoFisher Scientific | BP171-25 | Electrophoresis grade |
| Phenol red (solid) | thermoFisher Scientific | P74-10 | Free acid |
| Q Mini H Ion Exchange Column | Vivapure | VS-IX01QH24 | Ion exchange column must have minimum loading volume of 0.4mL, working pH of 2-12, and selectivity for ionic groups with pKa of 11 |
| Silver nitrate (solid) | thermoFisher Scientific | S181-25 | certified ACS |
| Sodium Acetate (solid) | ThermoFisher Scientific | S210-500 | Molecular biology grade |
| Sodium chloride (solid) | thermoFisher Scientific | S271-500 | Molecular biology grade |
| Sodium hydroxide (solid) | thermoFisher Scientific | S392-212 | |
| Sucrose (solid) | thermoFisher Scientific | BP220-1 | Molecular biology grade |
| TEMED (N,N,N',N'-tetramethylenediamine) | thermoFisher Scientific | BP150-20 | Electrophoresis grade |
| Tris base (solid) | thermoFisher Scientific | BP152-500 | Molecular biology grade |
| Ultra Centrifugal filters, 0.5mL, 3000 Da molecular weight cutoff | Amicon | UFC500324 | Larger volume filter units may be used, depending on sample size. |
| Urea (solid) | ThermoFisher Scientific | 29700 | |
| Vacufuge Plus | Eppendorf | 22820001 | Any rotational vacuum concentrator will work; can be replaced with lyophilizer |
| Vacuum filter unit, single use, 0.22uM pore PES, 500mL volume | thermoFisher Scientific | 569-0020 | Alternative volumes and filter materials acceptable |
Referências
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