Påvisning av glykosaminoglykaner ved polyakrylamidgelelektroforese og sølvfarging
Summary
Denne rapporten beskriver teknikker for å isolere og rense sulfaterte glykosaminoglykaner (GAG) fra biologiske prøver og en polyakrylamidgelelektroforese tilnærming til omtrentlig størrelse. GAG bidrar til vevsstruktur og påvirker signalprosesser via elektrostatisk interaksjon med proteiner. GAG polymer lengde bidrar til deres bindende affinitet for cognate ligander.
Abstract
Sulfaterte glykosaminoglykaner (GAG) som heparansulfat (HS) og kondroitinsulfat (CS) er allestedsnærværende i levende organismer og spiller en kritisk rolle i en rekke grunnleggende biologiske strukturer og prosesser. Som polymerer eksisterer GAG-er som en polydisperse blanding som inneholder polysakkaridkjeder som kan variere fra 4000 Da til godt over 40.000 Da. Innenfor disse kjedene finnes domener av sulfatasjon, og gir et mønster av negativ ladning som letter samspillet med positivt ladede rester av cognateproteinligander. Sulfaterte domener av GAG-er må ha tilstrekkelig lengde for å tillate disse elektrostatiske interaksjonene. For å forstå funksjonen til GAG-er i biologisk vev, må undersøkeren kunne isolere, rense og måle størrelsen på GAG-er. Denne rapporten beskriver en praktisk og allsidig polyakrylamidgelelektroforesebasert teknikk som kan utnyttes til å løse relativt små forskjeller i størrelse mellom GAG-er isolert fra en rekke biologiske vevstyper.
Introduction
Glykosaminoglykaner (GAG) er en mangfoldig familie av lineære polysakkarider som er et allestedsnærværende element i levende organismer og bidrar til mange grunnleggende fysiologiske prosesser1. GAG-er som heparansulfat (HS) og kondroitinsulfat (CS) kan bli sulfatert i forskjellige posisjoner langs polysakkaridkjeden, og gir geografiske domener med negativ ladning. Disse GAG-ene, når de er bundet til celleoverflateproteiner kjent som proteoglykaner, projiserer inn i det ekstracellulære rommet og binder seg til cognate-ligander, noe som muliggjør regulering av både cis- (ligand festet til samme celle) og trans- (ligand festet til nabocellen) signalprosesser2. Videre utfører GAG også kritiske roller som strukturelle elementer i vev som den glomerulære kjellermembranen3, vaskulær endotelglykokalyx4 og lungeeplytelformet glykokalyx5, og i bindevev som brusk6.
Lengden på GAG polysakkaridkjeder varierer betydelig i henhold til den biologiske konteksten og kan forlenges, spaltes og modifiseres dynamisk av et svært komplekst enzymatisk reguleringssystem7. Viktigst, lengden på GAG polymerkjeder bidrar vesentlig til deres bindende affinitet for ligander og deretter til deres biologiske funksjon8,9. Av denne grunn krever bestemmelse av funksjonen til en endogen GAG verdsettelse av størrelsen. Dessverre, i motsetning til proteiner og nukleinsyrer, finnes det svært få lett tilgjengelige teknikker for å oppdage og måle GAG-er, noe som historisk har resultert i relativt begrenset undersøkelse av de biologiske rollene til denne mangfoldige polysakkaridfamilien.
Denne artikkelen beskriver hvordan du isolerer og renser GAG-er fra de fleste biologiske vev, og beskriver også hvordan du bruker polyakrylamid gelelektroforese (PAGE) for å evaluere lengden på de isolerte polymerene med en god grad av spesifisitet. I motsetning til andre svært komplekse (og ofte massespektrometribaserte) glykomiske tilnærminger, kan denne metoden brukes ved hjelp av standard laboratorieutstyr og teknikker. Denne praktiske tilnærmingen kan derfor utvide etterforskernes evne til å bestemme den biologiske rollen til innfødte GAG-er og deres interaksjon med kontekstuelt viktige ligander.
Protocol
Representative Results
Discussion
GAG-er spiller en sentral rolle i mange ulike biologiske prosesser. En av hovedfunksjonene til sulfaterte GAG-er (som HS og CS) er å samhandle med og binde seg til ligander, noe som kan endre nedstrøms signalfunksjoner. En viktig determinant for GAG-bindingsaffinitet for å cognate ligander er lengden på GAG polymerkjeden 8,9,14. Derfor er det viktig for forskerne å kunne definere med rimelig presisjon størrelsen på GAG-kj…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble finansiert av F31 HL143873-01 (WBL), R01 HL125371 (RJL og EPS)
Materials
| Accuspin Micro17 benchtop microcentrifuge | thermoFisher Scientific | 13-100-675 | Any benchtop microcentrifuge/rotor combination capable of 14000 xG is appropriate |
| Acrylamide (solid) | thermoFisher Scientific | BP170-100 | Electrophoresis grade |
| Actinase E | Sigma Aldrich | P5147 | Protease mix from S. griseus |
| Alcian Blue 8GX (solid) | thermoFisher Scientific | AC400460100 | |
| Ammonium acetate (solid) | thermoFisher Scientific | A639-500 | Molecular biology grade |
| Ammonium hydroxide (liquid) | thermoFisher Scientific | A669S-500 | certified ACS |
| Ammonium persulfate (solid) | thermoFisher Scientific | BP179-25 | electrophoresis grade |
| Barnstead GenPure Pro Water Purification System | ThermoFisher Scientific | 10-451-217PKG | Any water deionizing/ purification system is an acceptable substitute |
| Boric acid (solid) | thermoFisher Scientific | A73-500 | Molecular biology grade |
| Bromphenol blue (solid) | thermoFisher Scientific | B392-5 | |
| Calcium acetate (solid) | ThermoFisher Scientific | 18-609-432 | Molecular biology grade |
| Calcium chloride (solid) | ThermoFisher Scientific | AC349610250 | Molecular biology grade |
| CHAPS detergent (3-((3-cholamidopropyl) dimethylammonio)-1-propanesulfonate) | ThermoFisher Scientific | 28299 | |
| Chondroitinase ABC | Sigma Aldrich | C3667 | |
| Criterion empty cassette for PAGE (1.0mm thick, 12+2 wells) | Bio-Rad | 3459901 | Any 1.0mm thick PAGE casting cassette system will suffice |
| Criterion PAGE Cell system (cell and power supply) | Bio-Rad | 1656019 | any comparable vertical gel PAGE system will work) |
| Dichloromethane (liquid) | thermoFisher Scientific | AC610931000 | certified ACS |
| EDTA disodium salt (solid) | thermoFisher Scientific | 02-002-786 | Molecular biology grade |
| Glacial acetic acid (liquid) | thermoFisher Scientific | A35-500 | Certified ACS |
| Glycine (solid) | thermoFisher Scientific | G48-500 | Electrophoresis grade |
| Heparanase I/III | Sigma Aldrich | H3917 | From Flavobacterium heparinum |
| Heparin derived decasaccharide (dp10) | galen scientific | HO10 | |
| Heparin derived hexasaccharde (dp6) | Galen scientific | HO06 | |
| Heparin derived oligosaccharide (dp20) | galen scientific | HO20 | |
| Hydrochloric acid (liquid) | thermoFisher Scientific | A466-250 | |
| Lyophilizer | Labconco | 7752020 | Any lyophilizer that can achieve -40C and 0.135 Torr will work; can also be replaced with rotational vacuum concentrator |
| Methanol (liquid) | thermoFisher Scientific | A412-500 | Certified ACS |
| Molecular Imager Gel Doc XR System | Bio-Rad | 170-8170 | Any comparable gel imaging system is an acceptable substitute |
| N,N'-methylene-bis-acrylamide (solid) | thermoFisher Scientific | BP171-25 | Electrophoresis grade |
| Phenol red (solid) | thermoFisher Scientific | P74-10 | Free acid |
| Q Mini H Ion Exchange Column | Vivapure | VS-IX01QH24 | Ion exchange column must have minimum loading volume of 0.4mL, working pH of 2-12, and selectivity for ionic groups with pKa of 11 |
| Silver nitrate (solid) | thermoFisher Scientific | S181-25 | certified ACS |
| Sodium Acetate (solid) | ThermoFisher Scientific | S210-500 | Molecular biology grade |
| Sodium chloride (solid) | thermoFisher Scientific | S271-500 | Molecular biology grade |
| Sodium hydroxide (solid) | thermoFisher Scientific | S392-212 | |
| Sucrose (solid) | thermoFisher Scientific | BP220-1 | Molecular biology grade |
| TEMED (N,N,N',N'-tetramethylenediamine) | thermoFisher Scientific | BP150-20 | Electrophoresis grade |
| Tris base (solid) | thermoFisher Scientific | BP152-500 | Molecular biology grade |
| Ultra Centrifugal filters, 0.5mL, 3000 Da molecular weight cutoff | Amicon | UFC500324 | Larger volume filter units may be used, depending on sample size. |
| Urea (solid) | ThermoFisher Scientific | 29700 | |
| Vacufuge Plus | Eppendorf | 22820001 | Any rotational vacuum concentrator will work; can be replaced with lyophilizer |
| Vacuum filter unit, single use, 0.22uM pore PES, 500mL volume | thermoFisher Scientific | 569-0020 | Alternative volumes and filter materials acceptable |
Referências
- LaRivière, W. B., Schmidt, E. P. The pulmonary endothelial glycocalyx in ARDS: A critical role for heparan sulfate. Current Topics in Membrane. 82, 33-52 (2018).
- Haeger, S. M., Yang, Y., Schmidt, E. P. Heparan sulfate in the developing, healthy, and injured lung. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 55 (1), 5-11 (2016).
- Morita, H., Yoshimura, A., Kimata, K. The role of heparan sulfate in the glomerular basement membrane. Kidney International. 73 (3), 247-248 (2008).
- Schmidt, E. P., et al. The pulmonary endothelial glycocalyx regulates neutrophil adhesion and lung injury during experimental sepsis. Nature Medicine. 18 (8), 1217-1223 (2012).
- Haeger, S. M., et al. Epithelial heparan sulfate contributes to alveolar barrier function and is shed during lung injury. American Journal of Respiratry Cell and Molecular Biology. 59 (3), 363-374 (2018).
- Mankin, H. J., Lippiello, L. The glycosaminoglycans of normal and arthritic cartilage. Journal of Clinical Investigation. 50 (8), 1712-1719 (1971).
- Annaval, T., et al. Heparan sulfate proteoglycans biosynthesis and post synthesis mechanisms combine few enzymes and few core proteins to generate extensive structural and functional diversity. Molecules. 25 (18), (2020).
- Zhang, F., et al. Comparison of the interactions of different growth factors and glycosaminoglycans. Molecules. 24 (18), (2019).
- Pempe, E. H., Xu, Y., Gopalakrishnan, S., Liu, J., Harris, E. N. Probing structural selectivity of synthetic heparin binding to Stabilin protein receptors. Journal of Biological Chemistry. 287 (25), 20774-20783 (2012).
- Cowman, M. K., et al. Polyacrylamide-gel electrophoresis and Alcian Blue staining of sulphated glycosaminoglycan oligosaccharides. Biochemical Journal. 221 (3), 707-716 (1984).
- Møller, H. J., Poulsen, J. H. Improved method for silver staining of glycoproteins in thin sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gels. Analytical Biochemistry. 226 (2), 371-374 (1995).
- Min, H., Cowman, M. K. Combined alcian blue and silver staining of glycosaminoglycans in polyacrylamide gels: Application to electrophoretic analysis of molecular weight distribution. Analytical Biochemistry. 155 (2), 275-285 (1986).
- Jay, G. D., Culp, D. J., Jahnke, M. R. Silver staining of extensively glycosylated proteins on sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels: Enhancement by carbohydrate-binding dyes. Analytical Biochemistry. 185 (2), 324-330 (1990).
- Abraham, E., et al. Liposomal prostaglandin E1 (TLC C-53) in acute respiratory distress syndrome: a controlled, randomized, double-blind, multicenter clinical trial. TLC C-53 ARDS Study Group. Critical Care Medicine. 27 (8), 1478-1485 (1999).
- Pervin, A., al-Hakim, A., Linhardt, R. J. Separation of glycosaminoglycan-derived oligosaccharides by capillary electrophoresis using reverse polarity. Analytical Biochemistry. 221 (1), 182-188 (1994).
- Wang, Z., Zhang, F., Dordick, J. S., Linhardt, R. J. Molecular mass characterization of glycosaminoglycans with different degrees of sulfation in bioengineered heparin process by size exclusion chromatography. Current Analytical Chemistry. 8 (4), 506-511 (2012).
- Pepi, L. E., Sanderson, P., Stickney, M., Amster, I. J. Developments in mass spectrometry for glycosaminoglycan analysis: A review. Molecular and Cellular Proteomics. , 100025 (2021).
- Whiteman, P. The quantitative measurement of Alcian Blue-glycosaminoglycan complexes. Biochemical Journal. 131 (2), 343-350 (1973).
- Yuan, H., et al. Molecular mass dependence of hyaluronan detection by sandwich ELISA-like assay and membrane blotting using biotinylated hyaluronan binding protein. Glycobiology. 23 (11), 1270-1280 (2013).
