JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Tadução automática
Imunologia e Infecção

Gene Knock-in af CRISPR / Cas9 og Celle sortering i makrofag og T Cellelinjer

Published: November 13, 2021
doi:
10.3791/62328
, , , , , , , , ,
1The Laboratory of Genetic Regulators in the Immune System, School of Laboratory Medicine,Xinxiang Medical University, 2Centre d’Immunologie de Marseille-Luminy,Aix Marseille Université

Summary

Denne protokol bruger fluorescerende journalister og cellesortering til at forenkle knock-in eksperimenter i makrofag og T cellelinjer. To plasmider anvendes til disse forenklede knock-in eksperimenter, nemlig en CRISPR/Cas9- og DsRed2-udtrykke plasmid og en homolog rekombination donor plasmid udtrykke EBFP2, som er permanent integreret på Rosa26 græshoppe i immunceller.

Abstract

Funktionelle genomforskninger af immunsystemet kræver genetiske manipulationer, der involverer både sletning af målgener og tilsætning af elementer til proteiner af interesse. Identifikation af genfunktioner i cellelinjemodeller er vigtig for genopdagelse og udforskning af celle iboende mekanismer. Men genetiske manipulationer af immunceller som T-celler og makrofag cellelinjer ved hjælp af CRISPR/Cas9-medieret knock-in er vanskelige på grund af den lave transfection effektivitet af disse celler, især i en quiescent tilstand. For at ændre gener i immunceller, lægemiddelresistens udvælgelse og virale vektorer bruges typisk til at berige for celler, der udtrykker CRIPSR / Cas9-systemet, hvilket uundgåeligt resulterer i uønsket indgriben af cellerne. I en tidligere undersøgelse designede vi dobbelt fluorescerende journalister koblet til CRISPR /Cas9, der blev forbigående udtrykt efter elektroporation. Denne tekniske løsning fører til hurtig gensletning i immunceller; gen knock-in i immunceller som T-celler og makrofager uden brug af valg af lægemiddelresistens eller virale vektorer er endnu mere udfordrende. I denne artikel viser vi, at ved at bruge cellesortering til at hjælpe med udvælgelse af celler, der forbigående udtrykker CRISPR / Cas9-konstruktioner rettet mod Rosa26-locus i kombination med en donorplasmid, kan gen knock-in opnås i både T-celler og makrofager uden lægemiddelresistensberigelse. Som et eksempel viser vi, hvordan man udtrykker human ACE2, en receptor af SARS-Cov-2, som er ansvarlig for den nuværende Covid-19-pandemi, i RAW264.7 makrofager ved at udføre knock-in eksperimenter. Sådanne gen knock-in celler kan i vid udstrækning anvendes til mekanistiske undersøgelser.

Introduction

Immunceller er afgørende for forsvar mod patogener. Både medfødt og adaptiv immunitet er nødvendig for clearance af infectants og vedligeholdelse af væv homøostase1,2. Cellelinjemodeller er vigtige værktøjer til at forstå de molekylære fundamentale elementer i pattedyrs immunsystem; de anvendes i in vitro funktionelle assays, såsom dem modellering human T-celle aktivering, og til bestemmelse af funktionen af genetiske faktorer i aktivering eller dæmpning immunrespons3,4. Det er vigtigt at bemærke, at pattedyrets immunsystem er enormt heterogent, og lige så vigtigt styrer et stort antal molekyler differentiering, migration og funktion af en given celletype5,6.

Grupperet Regelmæssigt Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)/Cas9 genom redigeringsværktøjer giver mulighed for genetisk manipulation af specifikke celletyper, hvilket letter funktionel anmærkning af gener på en præcis måde7,8. Flere offentliggjorte protokoller har beskrevet leveringen af CRISPR/Cas9 i form af Cas9-guide RNA-komplekser kendt som ribonucleoproteiner (RNG’er) i HEK293-celler, Jurkat-cellelinjer, primære T-celler9,10, makrofager11,12,13, stamceller14og andre15,16. I disse protokoller opnås genmærkning normalt ved at sammensmelte et fluorescerende tag til endogene proteiner17,18. Men få forsøg er gjort for at bruge dobbelt fluorescerende reportere, som er kompatible med enkelt celle sortering, at lette knock-in eksperimenter19,20, især i immunceller.

Dybdegående mekanistiske analyser, der har til formål at forstå funktionerne i en ny genetisk faktor i immunceller, kræver generelt celletypespecifik sletning af et gen, genetiske redningsforsøg og ideelt identifikation af dets interactorer. Selvom metoder til optimering af genetisk sletning af gener i immunceller er blevet offentliggjort9,15,21, langt færre metoder er blevet rapporteret til at indføre knock-in alleler med alsidige funktioner til at forstå immunresponset. Derfor sigter vi i denne protokol mod i detaljer at beskrive en effektiv og meget reproducerbar protokol til at udtrykke et protein af interesse (POI) på safe harbor locus Rosa26 i både menneskelige og murin immuncellelinjer. Vi designede et tofarvet reportersystem til at berige celler transfected med plasmider, der udtrykker CRISPR / Cas9 (DsRed2) og en rekombinant DNA-skabelon (EBFP2), som kan isoleres ved cellesortering. Efter denne protokol opnåede vi flere knock-in linjer af den menneskelige T-cellelinje Jurkat og murine makrofag RAW264.7 til funktionelle analyser af dårligt studerede proteiner.

Som et eksempel viser vi i denne protokol, hvordan man får knock-in RAW264.7 makrofager, der stabilt udtrykker human ACE2 (en receptor af SARS-Cov-2)22. Fordi medfødte immunceller er involveret i patogenesen af Covid-1923,24 og human ACE2 betragtes som en vigtig receptor, der kræves for viral indrejse i celler før replikation, makrofager med knock-in af menneskelige ACE2 kan tjene som et nyttigt redskab til mekanistiske undersøgelser af viral multiplikation inde makrofager. Parallelt, vi også præsentere et eksempel på knock-in af et gen på den menneskelige ROSA26 græshoppe til at udtrykke RASGRP1 protein, som blev smeltet på sin amino endestation med en affinitet Twin-Strep-tag (OST). T-celler er centrale målceller i immunterapier, og et stigende antal undersøgelser har fokuseret på manipulation af deres reaktionsevne over for kræft25,26. Som Rasgrp1 er kendt for at være en vigtig signalering molekyle nedstrøms af T-celle receptor og dens interactors er ikke godt belyst27, OST-RASGRP1 knock-in model giver grundlaget for at identificere interactors regulerer reaktionen af T-celler til tumorer og infektion. Samlet set kan disse værktøjer bruges til Covid-19-studier og opdagelsen af nye molekyler, der interagerer med Rasgrp1.

Protocol

1. Design og Plasmid Opførelse af SGRNAs Målretning Rosa26 Locus Design guide RNA’er omkring det ønskede indsætningswebsted Sørg for, at indføringsstedet for mus Rosa26 (i det følgende benævnt mRosa26) knock-in eksperimenter er placeret i den første intron af mRosa26; dette websted er blevet anvendt i tidligere undersøgelser28,29. For knock-in forsøg i menneskelig…

Representative Results

Efter protokollen beskrevet ovenfor til at udføre knock-in eksperimenter på mRosa26 græshoppe ved hjælp af murine RAW264.7 makrofager, vi designet en målretning vektor til at udtrykke menneskelige ACE2, en receptor for SARS-Cov-2 virus (Figur 2A). Ved hjælp af et lignende design genererede vi menneskelige Jurkat T-celler med knock-in af ost-mærket RASGRP1 fusion protein (Figur 2C). Efter transfektion af tre plasmider, hvoraf to blev brugt til udt…

Discussion

I vores eksperimenter demonstrerede vi, hvordan man udfører knock-in redigering i immunceller fra konstruktionsdesign til knock-in cellescreening og validering ved hjælp af menneskelige Jurkat T-celler og murin RAW264.7 makrofager som eksempler. Både T-celle- og makrofagscellelinjer er modstandsdygtige over for transfection36,37; Problemet med lav effektivitet af CRISPR/Cas9-levering kan imidlertid løses ved hjælp af fluorescerende journalister kombineret me…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi takker flowcytometrikernefaciliteten på Xinxiang Medical University. Udviklingen af en sådan teknologi er blevet støttet af NSFC-tilskud 81601360 til LZ, 81471595 og 32070898 til YL. Arbejdet er også støttet af Foundation of Henan Educational Committee No. 21IRTSTHN030.

Materials

Amersham Imager 600 Ge Healthcare imaging of chemiluminescence
Ampicillin, sodium salt MP Biomedicals 194526
Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody Cell Signaling Technology 7074 at 1/5000 dilution
Anti-RasGRP1 antibody, clone 10.1 Merck MABS146 1.0 μg/mL of working concentration
AscI New England BioLabs R0558S
β-Actin (D6A8) Rabbit mAb Cell Signaling Technology 8457 at 1/1000 dilution
BamHI-HF New England BioLabs R3136S
BbsI-HF New England BioLabs R3539S
Cellometer Mini Automated Cell Counter Nexcelom Bioscience
E.coli DH5α Competent Cells Takara 9057
DMSO (Dimethyl Sulfoxide) MP Biomedicals 196055
DNeasy Blood & Tissue Kits Qiagen 69506 cell culture reagent
DPBS (10X), no calcium, no magnesium ThermoFisher Scientific 14200075
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) with high glucose HyClone SH30022.01
EcoRI-HF New England BioLabs R3101S
FACSAria™ Fusion BD Biosciences equipped with biosafety cabinet
FACS Canto flow cytometer BD Biosciences
Falcon 5 ml polystyrene round bottom test tube BD Biosciences 352003
Fetal bovine serum (FBS) ThermoFisher Scientific 10099141
FlowJo version 10.7 BD Biosciences
GAPDH (D16H11) XP Rabbit mAb Cell Signaling Technology 5174 at 1/1000 dilution
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP ThermoFisher Scientific 31430 at 1/5000 dilution
Immobilon ECL Ultra Western HRP Substrate Millipore WBKLS0500
Immobilon-PSQ PVDF Membrane Millipore ISEQ00010
Jurkat ATCC TIB-152 https://www.atcc.org/
Kanamycin sulfate MP Biomedicals 194531
LB agar powder ThermoFisher Scientific 22700041
Multi-channel Pipette (30-300 μL) Eppendorf, or similar
Neon Transfection System ThermoFisher Scientific MPK5000
Neon Transfection System, 10 μL kit ThermoFisher Scientific MPK1096
Nunc 15 mL Conical Sterile Centrifuge Tubes ThermoFisher Scientific 339651
OneTaq® Hot Start Quick-Load® 2X Master Mix New England BioLabs (M0489) for high GC% template
PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa ThermoFisher Scientific 26616
Pipette tip 0.1-20µl Eppendorf, or similar 0030 075.005
Pipette tip 2-200µl Eppendorf, or similar 0030 075.021
Pipette tip 50-1000µl Eppendorf, or similar 0030 075.064
Plasmid Maxi Kit Qiagen 12163
pX458-DsRed2 Addgene 112219
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen 28104 purify plasmid from restriction digestion
Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix New England BioLabs M0494S
RAW264.7 ATCC TIB-71 https://www.atcc.org/
Recombinant Anti-ACE2 antibody [EPR4435(2)] Abcam ab108252 at 1/1000 dilution
RPMI 1640 Medium HyClone SH30027.01
Strep-Tactin Sepharose beads IBA Lifesciences 2-1201-010
Penicillin-Streptomycin ThermoFisher Scientific 15140122
SYTOX™ Red Dead Cell Stain, for 633 or 635 nm excitation ThermoFisher Scientific S34859
T4 DNA ligase New England BioLabs M0202S
T4 Polynucleotide Kinase New England BioLabs M0201S
Trypan Blue Solution, 0.4% ThermoFisher Scientific 15250061
Trypsin-EDTA solution (0.25%), with phenol red ThermoFisher Scientific 25200056
ZOE Fluorescent Cell Imager Bio-Rad
1.5 mL microtubes, PCR-clean Eppendorf, or similar 0030 125.215
24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates Corning 3524
96-well Clear Flat Bottom Polystyrene TC-treated Microplates Corning 3599
96-well Clear Round Bottom TC-treated Microplate Corning 3799
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Cronkite, D. A., Strutt, T. M. The Regulation of Inflammation by Innate and Adaptive Lymphocytes. Journal of Immunology Research. 2018, 1467538 (2018).
  2. Iwasaki, A., Medzhitov, R. Control of adaptive immunity by the innate immune system. Nature Immunology. 16 (4), 343-353 (2015).
  3. Chicaybam, L., et al. An Efficient Electroporation Protocol for the Genetic Modification of Mammalian Cells. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 99 (2016).
  4. Manguso, R. T., et al. In vivo CRISPR screening identifies Ptpn2 as a cancer immunotherapy target. Nature. 547 (7664), 413-418 (2017).
  5. Siggs, O. M. Dissecting mammalian immunity through mutation. Immunology and Cell Biology. 92 (5), 392-399 (2014).
  6. Satija, R., Shalek, A. K. Heterogeneity in immune responses: from populations to single cells. Trends in Immunology. 35 (5), 219-229 (2014).
  7. Shui, B., Hernandez Matias, L., Guo, Y., Peng, Y. The Rise of CRISPR/Cas for Genome Editing in Stem Cells. Stem Cells International. 2016, 8140168 (2016).
  8. Komor, A. C., Badran, A. H., Liu, D. R. CRISPR-Based Technologies for the Manipulation of Eukaryotic Genomes. Cell. 168 (1-2), 20-36 (2017).
  9. Seki, A., Rutz, S. Optimized RNP transfection for highly efficient CRISPR/Cas9-mediated gene knockout in primary T cells. Journal of Experimental Medicine. 215 (3), 985-997 (2018).
  10. Oh, S. A., Seki, A., Rutz, S. Ribonucleoprotein Transfection for CRISPR/Cas9-Mediated Gene Knockout in Primary T Cells. Current Protocols in Immunology. 124 (1), 69 (2019).
  11. Lee, Y. W., et al. In Vivo Editing of Macrophages through Systemic Delivery of CRISPR-Cas9-Ribonucleoprotein-Nanoparticle Nanoassemblies. Advances in Therapy (Weinh). 2 (10), (2019).
  12. Freund, E. C., et al. Efficient gene knockout in primary human and murine myeloid cells by non-viral delivery of CRISPR-Cas9. Journal of Experimental Medicine. 217 (7), (2020).
  13. Huang, R., et al. The three members of the Vav family proteins form complexes that concur to foam cell formation and atherosclerosis. Journal of Lipid Research. 60 (12), 2006-2019 (2019).
  14. Scharenberg, S. G., et al. Engineering monocyte/macrophage-specific glucocerebrosidase expression in human hematopoietic stem cells using genome editing. Nature Communications. 11 (1), 3327 (2020).
  15. Jacobi, A. M., et al. Simplified CRISPR tools for efficient genome editing and streamlined protocols for their delivery into mammalian cells and mouse zygotes. Methods. 121-122, 16-28 (2017).
  16. Liang, X., Potter, J., Kumar, S., Ravinder, N., Chesnut, J. D. Enhanced CRISPR/Cas9-mediated precise genome editing by improved design and delivery of gRNA, Cas9 nuclease, and donor DNA. Journal of Biotechnology. 241, 136-146 (2017).
  17. Haupt, A., Grancharova, T., Arakaki, J., Fuqua, M. A., Roberts, B., Gunawardane, R. N. Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9. Journal of Visualized Experiments. (138), (2018).
  18. Li, S., Xue, H., Long, B., Sun, L., Truong, T., Liu, Y. Efficient generation of hiPSC neural lineage specific knockin reporters using the CRISPR/Cas9 and Cas9 double nickase system. Journal of Visualized Experiments. (99), e52539 (2015).
  19. Schumann, K., et al. Generation of knock-in primary human T cells using Cas9 ribonucleoproteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (33), 10437-10442 (2015).
  20. Hamilton, J. R., et al. Targeted delivery of CRISPR-Cas9 and transgenes enables complex immune cell engineering. Cell Reports. 35 (9), 109207 (2021).
  21. Luo, J., et al. Speed genome editing by transient CRISPR/Cas9 targeting and large DNA fragment deletion. Journal of Biotechnology. 281, 11-20 (2018).
  22. Bourgonje, A. R., et al. Angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2), SARS-CoV-2 and the pathophysiology of coronavirus disease. Journal of Pathology. 251 (3), 228-248 (2020).
  23. Schultze, J. L., Aschenbrenner, A. C. COVID-19 and the human innate immune system. Cell. 184 (7), 1671-1692 (2021).
  24. Taefehshokr, N., Taefehshokr, S., Hemmat, N., Heit, B. Covid-19: Perspectives on Innate Immune Evasion. Frontiers in Immunology. 11 (2549), (2020).
  25. Waldman, A. D., Fritz, J. M., Lenardo, M. J. A guide to cancer immunotherapy: from T cell basic science to clinical practice. Nature Reviews: Immunology. 20 (11), 651-668 (2020).
  26. Chandran, S. S., Klebanoff, C. A. T cell receptor-based cancer immunotherapy: Emerging efficacy and pathways of resistance. Immunological Reviews. 290 (1), 127-147 (2019).
  27. Dower, N. A., et al. RasGRP is essential for mouse thymocyte differentiation and TCR signaling. Nature Immunology. 1 (4), 317-321 (2000).
  28. Soriano, P. Generalized lacZ expression with the ROSA26 Cre reporter strain. Nature Genetics. 21 (1), 70-71 (1999).
  29. Chu, V. T., et al. Efficient generation of Rosa26 knock-in mice using CRISPR/Cas9 in C57BL/6 zygotes. BMC Biotechnology. 16, 4 (2016).
  30. Irion, S., Luche, H., Gadue, P., Fehling, H. J., Kennedy, M., Keller, G. Identification and targeting of the ROSA26 locus in human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (12), 1477-1482 (2007).
  31. Concordet, J. -. P., Haeussler, M. CRISPOR: intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens. Nucleic Acids Research. 46, 242-245 (2018).
  32. Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biology. 17 (1), 148 (2016).
  33. Jang, D. E., et al. Multiple sgRNAs with overlapping sequences enhance CRISPR/Cas9-mediated knock-in efficiency. Experimental and Molecular Medicine. 50 (4), 1-9 (2018).
  34. Miura, H., Quadros, R. M., Gurumurthy, C. B., Ohtsuka, M. Easi-CRISPR for creating knock-in and conditional knockout mouse models using long ssDNA donors. Nature Protocols. 13 (1), 195-215 (2018).
  35. Paix, A., Rasoloson, D., Folkmann, A., Seydoux, G. Rapid Tagging of Human Proteins with Fluorescent Reporters by Genome Engineering using Double-Stranded DNA Donors. Current Protocols in Molecular Biology. 129 (1), 102 (2019).
  36. Ebert, O., et al. Lymphocyte apoptosis: induction by gene transfer techniques. Gene Therapy. 4 (4), 296-302 (1997).
  37. Zhang, X., Edwards, J. P., Mosser, D. M. The expression of exogenous genes in macrophages: obstacles and opportunities. Methods in Molecular Biology. 531, 123-143 (2009).
  38. Chu, V. T., et al. Efficient CRISPR-mediated mutagenesis in primary immune cells using CrispRGold and a C57BL/6 Cas9 transgenic mouse line. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (44), 12514-12519 (2016).
  39. Banan, M. Recent advances in CRISPR/Cas9-mediated knock-ins in mammalian cells. Journal of Biotechnology. 308, 1-9 (2020).
  40. Roberts, B., et al. Systematic gene tagging using CRISPR/Cas9 in human stem cells to illuminate cell organization. Molecular Biology of the Cell. 28 (21), 2854-2874 (2017).
  41. Bukhari, H., Müller, T. Endogenous Fluorescence Tagging by CRISPR. Trends in Cell Biology. 29 (11), 912-928 (2019).
  42. Koch, B., Nijmeijer, B., Kueblbeck, M., Cai, Y., Walther, N., Ellenberg, J. Generation and validation of homozygous fluorescent knock-in cells using CRISPR-Cas9 genome editing. Nature Protocols. 13 (6), 1465-1487 (2018).
  43. Abraham, R. T., Weiss, A. Jurkat T cells and development of the T-cell receptor signalling paradigm. Nature Reviews Immunology. 4 (4), 301-308 (2004).
  44. Freen-van Heeren, J. J. -., Popović, B., Guislain, A., Wolkers, M. C. Human T cells employ conserved AU-rich elements to fine-tune IFN-γ production. European Journal of Immunology. 50 (7), 949-958 (2020).
  45. Roncagalli, R., et al. The scaffolding function of the RLTPR protein explains its essential role for CD28 co-stimulation in mouse and human T cells. Journal of Experimental Medicine. 213 (11), 2437-2457 (2016).
  46. He, L., et al. ARHGAP45 controls naïve T- and B-cell entry into lymph nodes and T-cell progenitor thymus seeding. EMBO Reports. 22 (4), 52196 (2021).
  47. Sadelain, M., Papapetrou, E. P., Bushman, F. D. Safe harbours for the integration of new DNA in the human genome. Nature Reviews: Cancer. 12 (1), 51-58 (2011).
  48. Papapetrou, E. P., Gene Schambach, A. Insertion Into Genomic Safe Harbors for Human Gene Therapy. Molecular Therapy. 24 (4), 678-684 (2016).
  49. Wang, X., et al. A transgene-encoded cell surface polypeptide for selection, in vivo tracking, and ablation of engineered cells. Blood. 118 (5), 1255-1263 (2011).
  50. Eyquem, J., et al. Targeting a CAR to the TRAC locus with CRISPR/Cas9 enhances tumour rejection. Nature. 543 (7643), 113-117 (2017).

Tags

Keywords: CRISPR/Cas9Gene Knock-inMacrophageT Cell LinesROSA26 LocusSgRNA DesignHomologous RecombinationTargeting VectorFluorescent ReporterCell Sorting
check_url/pt/62328?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Zhang, L., Huang, R., Lu, L., Fu, R., Guo, G., Gu, Y., Liu, Z., He, L., Malissen, M., Liang, Y. Gene Knock-in by CRISPR/Cas9 and Cell Sorting in Macrophage and T Cell Lines. J. Vis. Exp. (177), e62328, doi:10.3791/62328 (2021).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image