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Imunologia e Infecção

CRISPR/Cas9 द्वारा जीन नॉक-इन और मैक्रोफेज और टी सेल लाइनों में सेल छंटाई

Published: November 13, 2021
doi:
10.3791/62328
, , , , , , , , ,
1The Laboratory of Genetic Regulators in the Immune System, School of Laboratory Medicine,Xinxiang Medical University, 2Centre d’Immunologie de Marseille-Luminy,Aix Marseille Université

Summary

यह प्रोटोकॉल मैक्रोफेज और टी सेल लाइनों में दस्तक प्रयोगों को सरल बनाने के लिए फ्लोरोसेंट रिपोर्टर्स और सेल छंटाई का उपयोग करता है। इन सरलीकृत दस्तक प्रयोगों के लिए दो प्लाज्मिड का उपयोग किया जाता है, नामत CRISPR/Cas9-और DsRed2-एक्सप्रेस प्लाज्मिड और एक मुताबिक़ रीकॉम्बिनेशन डोनर प्लाज्मिड व्यक्त करते हुए EBFP2, जो प्रतिरक्षा कोशिकाओं में Rosa26 लोकस में स्थायी रूप से एकीकृत है ।

Abstract

प्रतिरक्षा प्रणाली के कार्यात्मक जीनोमिक्स अध्ययनों के लिए आनुवंशिक जोड़तोड़ की आवश्यकता होती है जिसमें लक्ष्य जीन को हटाना और तत्वों को रुचि के प्रोटीन में शामिल करना शामिल है। सेल लाइन मॉडल में जीन कार्यों की पहचान जीन खोज और कोशिका-आंतरिक तंत्र की खोज के लिए महत्वपूर्ण है । हालांकि, इन कोशिकाओं की कम ट्रांसफेक्शन दक्षता, विशेष रूप से एक शांत राज्य में, के कारण CRISPR/Cas9-मध्यस्थता दस्तक का उपयोग कर टी कोशिकाओं और मैक्रोफेज सेल लाइनों के रूप में प्रतिरक्षा कोशिकाओं के आनुवंशिक जोड़तोड़ मुश्किल हैं । प्रतिरक्षा कोशिकाओं में जीन को संशोधित करने के लिए, दवा प्रतिरोध चयन और वायरल वैक्टर आम तौर पर CRIPSR/Cas9 प्रणाली है, जो अनिवार्य रूप से कोशिकाओं के अवांछनीय हस्तक्षेप में परिणाम व्यक्त कोशिकाओं के लिए समृद्ध करने के लिए उपयोग किया जाता है । पिछले एक अध्ययन में, हमने ड्यूल फ्लोरोसेंट रिपोर्टर्स को CRISPR/Cas9 के साथ मिलकर डिजाइन किया था जो इलेक्ट्रोपॉशन के बाद क्षणिक रूप से व्यक्त किए गए थे । यह तकनीकी समाधान प्रतिरक्षा कोशिकाओं में तेजी से जीन हटाने की ओर जाता है; हालांकि, दवा प्रतिरोध चयन या वायरल वैक्टर के उपयोग के बिना टी कोशिकाओं और मैक्रोफेज जैसी प्रतिरक्षा कोशिकाओं में जीन नॉक-इन और भी चुनौतीपूर्ण है। इस लेख में, हम बताते है कि कोशिकाओं के चयन में सहायता करने के लिए सेल छंटाई का उपयोग करके क्षणिक CRISPR व्यक्त/Cas9 एक दाता प्लाज्मिड के साथ संयोजन में Rosa26 लोकस को लक्षित निर्माण, जीन दस्तक में दोनों टी कोशिकाओं और दवा प्रतिरोध संवर्धन के बिना मैक्रोफेज में प्राप्त किया जा सकता है । एक उदाहरण के रूप में, हम दिखाते हैं कि कैसे मानव ACE2, सार्स-Cov-2 के एक रिसेप्टर, जो वर्तमान Covid-19 महामारी के लिए जिंमेदार है, RAW264.7 मैक्रोफेज में दस्तक प्रयोगों प्रदर्शन करके व्यक्त करने के लिए । इस तरह के जीन नॉक-इन कोशिकाओं को व्यापक रूप से मशीनी अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

Introduction

रोगजनकों के खिलाफ रक्षा के लिए प्रतिरक्षा कोशिकाएं महत्वपूर्ण हैं। संक्रमितों की निकासी और ऊतक होयोस्टेसिस1,2के रखरखाव के लिए जन्मजात और अनुकूली प्रतिरक्षा दोनों की आवश्यकता होती है । सेल लाइन मॉडल स्तनधारी प्रतिरक्षा प्रणाली के आणविक बुनियादी बातों को समझने के लिए आवश्यक उपकरण हैं; वे इस तरह के मानव टी सेल सक्रियण मॉडलिंग के रूप में इन विट्रो कार्यात्मक परख में उपयोग कियाजाताहै, और सक्रिय या प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं गीला करने में आनुवंशिक कारकों के समारोह का निर्धारण करने में 3 ,4. यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि स्तनधारी प्रतिरक्षा प्रणाली अत्यधिक विषम है और समान रूप से महत्वपूर्ण, बड़ी संख्या में अणु किसी दिए गए सेल टाइप5, 6के भेदभाव, प्रवासन और कार्य कोनियंत्रितकरते हैं।

क्लस्टर नियमित रूप से इंटरस्पेस्ड शॉर्ट पैलिंड्रोमिक रिपीट्स (CRISPR)/Cas9 जीनोम संपादन उपकरण विशिष्ट कोशिका प्रकारों के आनुवंशिक हेरफेर के लिए अनुमति देते हैं, जो सटीक तरीके से जीन के कार्यात्मक एनोटेशन की सुविधा प्रदान करता है7,8। कई प्रकाशित प्रोटोकॉल में CAS9-guide आरएनए परिसरों के रूप में CRISPR/Cas9 की डिलीवरी का वर्णन किया गया है जिसे एचईके293 कोशिकाओं, जुर्कत सेल लाइनों, प्राथमिक टी कोशिकाओं9,10,मैक्रोफेज11,12,13,स्टेम सेल14,और अन्य15, 16में रिबोन्यूक्लिकोप्रोटीन (आरएनपी) के रूप में जानाजाताहै । इन प्रोटोकॉलों में, जीन टैगिंग आमतौर पर एंडोजेनस प्रोटीन17,18को फ्लोरोसेंट टैग को फ्यूज करके हासिल की जाती है। हालांकि दोहरी फ्लोरोसेंट रिपोर्टर्स का उपयोग करने के लिए कुछ प्रयास किए गए हैं, जो एकल सेल छंटाई के साथ संगत हैं, ताकि विशेष रूप से प्रतिरक्षा कोशिकाओं में नॉक-इन प्रयोगों19,20की सुविधा प्रदान की जा सके।

प्रतिरक्षा कोशिकाओं में एक उपन्यास आनुवंशिक कारक के कार्यों को समझने के उद्देश्य से गहराई से मशीनी विश्लेषण आम तौर पर एक जीन के सेल प्रकार विशिष्ट हटाने की आवश्यकता होती है, आनुवंशिक बचाव प्रयोगों, और आदर्श रूप से अपने इंटरक्ट्राप्टर की पहचान । यद्यपि प्रतिरक्षा कोशिकाओं में जीन के आनुवंशिक विलोपन के अनुकूलन के तरीके प्रकाशित किए गए हैं9,15,21,प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को समझने के लिए बहुमुखी कार्यों के साथ नॉक-इन एलील्स शुरू करने के लिए बहुत कम तरीके बताए गए हैं। इसलिए, इस प्रोटोकॉल में हम मानव और मुरीन प्रतिरक्षा सेल लाइनों में सुरक्षित बंदरगाह लोकस Rosa26 में रुचि के प्रोटीन (पीओआई) को व्यक्त करने के लिए विस्तार से एक कुशल और अत्यधिक प्रजनन प्रोटोकॉल का वर्णन करने का लक्ष्य रखते हैं। हमने CRISPR/Cas9 (DsRed2) और एक पुनर्संयोजन डीएनए टेम्पलेट (EBFP2) को व्यक्त करने वाले प्लाज्मिड्स से संक्रमित कोशिकाओं के लिए समृद्ध करने के लिए एक दो रंग रिपोर्टर सिस्टम तैयार किया है, जिसे सेल छंटाई द्वारा अलग किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल के बाद, हमने खराब अध्ययन किए गए प्रोटीन के कार्यात्मक विश्लेषणों के लिए मानव टी सेल लाइन जुर्कट और मुरीन मैक्रोफेज RAW264.7 की कई दस्तक-इन लाइनें प्राप्त कीं।

एक उदाहरण के रूप में, हम इस प्रोटोकॉल में दिखाते हैं कि कैसे दस्तक-IN RAW264.7 मैक्रोफेज को मानव ACE2 (सार्स-Cov-2 का रिसेप्टर)22व्यक्त करते हैं। क्योंकि जन्मजात प्रतिरक्षा कोशिकाएं कोविड-1923, 24के रोगजनन में शामिल हैं और मानव ACE2 को प्रतिकृति से पहले कोशिकाओं में वायरल प्रवेश के लिए आवश्यक एक प्रमुख रिसेप्टर मानाजाता है, मानव ACE2 की दस्तक के साथ मैक्रोफेज मैक्रोफेज के अंदर वायरल गुणा के मशीनी अध्ययन के लिए एक उपयोगी उपकरण के रूप में काम कर सकते हैं। समानांतर में, हम RASGRP1 प्रोटीन को व्यक्त करने के लिए मानव ROSA26 लोकस में एक जीन की दस्तक का एक उदाहरण भी पेश करते हैं, जिसे एक आत्मीयता ट्विन-स्ट्रेप-टैग (OST) के साथ अपने अमीनो टर्मिनस पर मिला दिया गया था। टी कोशिकाएं प्रतिरक्षा चिकित्सा में प्रमुख लक्ष्य कोशिकाएं हैं, और अध्ययनों की बढ़ती संख्या ने कैंसर25,26के प्रति उनकी जवाबदेही में हेरफेर पर ध्यान केंद्रित किया है। के रूप में Rasgrp1 टी सेल रिसेप्टर के एक प्रमुख संकेत अणु बहाव के रूप में जाना जाता है और इसके इंटरएक्टिव्स अच्छी तरह से स्पष्ट नहीं कर रहे है27,OST-RASGRP1 दस्तक मॉडल ट्यूमर और संक्रमण के लिए टी कोशिकाओं की प्रतिक्रिया को विनियमित इंटरप्टर्स की पहचान करने के लिए नींव प्रदान करता है । एक साथ लिया, इन उपकरणों Covid-19 अध्ययन और Rasgrp1 के साथ बातचीत उपन्यास अणुओं की खोज के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

Protocol

1. डिजाइन और प्लाज्मिड SgRNAs के निर्माण Rosa26 लोकस लक्ष्यीकरण वांछित प्रविष्टि साइट के आसपास डिजाइन गाइड RNAs सुनिश्चित करें कि माउस Rosa26 के लिए प्रविष्टि साइट (इसके बाद mRosa26के रूप मे?…

Representative Results

मुरीन RAW264.7 मैक्रोफेज का उपयोग करके mRosa26 लोकस में दस्तक प्रयोग करने के लिए ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल के बाद, हमने मानव ACE2 को व्यक्त करने के लिए एक लक्ष्यीकरण वेक्टर तैयार किया, जो सार्स-कॉव-2 वायरस(चित?…

Discussion

हमारे प्रयोगों में, हमने प्रदर्शन किया कि उदाहरण के रूप में मानव जुरकट टी कोशिकाओं और मुरीन RAW264.7 मैक्रोफेज का उपयोग करके डिजाइन निर्माण डिजाइन से लेकर नॉक-इन सेल स्क्रीनिंग और सत्यापन तक प्रतिरक्षा को?…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

हम शिनजियांग मेडिकल यूनिवर्सिटी की फ्लो साइटोमेट्री कोर फैसिलिटी को धन्यवाद देते हैं । इस तरह की तकनीक के विकास को एनएसएफसी ने एलजेड, 81471595 और 32070898 को 81601360 आईएल के लिए अनुदान प्रदान किया है । इस काम को फाउंडेशन ऑफ हेलन एजुकेशनल कमेटी नंबर 21IRTSTHN030 का भी समर्थन है ।

Materials

Amersham Imager 600 Ge Healthcare imaging of chemiluminescence
Ampicillin, sodium salt MP Biomedicals 194526
Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody Cell Signaling Technology 7074 at 1/5000 dilution
Anti-RasGRP1 antibody, clone 10.1 Merck MABS146 1.0 μg/mL of working concentration
AscI New England BioLabs R0558S
β-Actin (D6A8) Rabbit mAb Cell Signaling Technology 8457 at 1/1000 dilution
BamHI-HF New England BioLabs R3136S
BbsI-HF New England BioLabs R3539S
Cellometer Mini Automated Cell Counter Nexcelom Bioscience
E.coli DH5α Competent Cells Takara 9057
DMSO (Dimethyl Sulfoxide) MP Biomedicals 196055
DNeasy Blood & Tissue Kits Qiagen 69506 cell culture reagent
DPBS (10X), no calcium, no magnesium ThermoFisher Scientific 14200075
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) with high glucose HyClone SH30022.01
EcoRI-HF New England BioLabs R3101S
FACSAria™ Fusion BD Biosciences equipped with biosafety cabinet
FACS Canto flow cytometer BD Biosciences
Falcon 5 ml polystyrene round bottom test tube BD Biosciences 352003
Fetal bovine serum (FBS) ThermoFisher Scientific 10099141
FlowJo version 10.7 BD Biosciences
GAPDH (D16H11) XP Rabbit mAb Cell Signaling Technology 5174 at 1/1000 dilution
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP ThermoFisher Scientific 31430 at 1/5000 dilution
Immobilon ECL Ultra Western HRP Substrate Millipore WBKLS0500
Immobilon-PSQ PVDF Membrane Millipore ISEQ00010
Jurkat ATCC TIB-152 https://www.atcc.org/
Kanamycin sulfate MP Biomedicals 194531
LB agar powder ThermoFisher Scientific 22700041
Multi-channel Pipette (30-300 μL) Eppendorf, or similar
Neon Transfection System ThermoFisher Scientific MPK5000
Neon Transfection System, 10 μL kit ThermoFisher Scientific MPK1096
Nunc 15 mL Conical Sterile Centrifuge Tubes ThermoFisher Scientific 339651
OneTaq® Hot Start Quick-Load® 2X Master Mix New England BioLabs (M0489) for high GC% template
PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa ThermoFisher Scientific 26616
Pipette tip 0.1-20µl Eppendorf, or similar 0030 075.005
Pipette tip 2-200µl Eppendorf, or similar 0030 075.021
Pipette tip 50-1000µl Eppendorf, or similar 0030 075.064
Plasmid Maxi Kit Qiagen 12163
pX458-DsRed2 Addgene 112219
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen 28104 purify plasmid from restriction digestion
Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix New England BioLabs M0494S
RAW264.7 ATCC TIB-71 https://www.atcc.org/
Recombinant Anti-ACE2 antibody [EPR4435(2)] Abcam ab108252 at 1/1000 dilution
RPMI 1640 Medium HyClone SH30027.01
Strep-Tactin Sepharose beads IBA Lifesciences 2-1201-010
Penicillin-Streptomycin ThermoFisher Scientific 15140122
SYTOX™ Red Dead Cell Stain, for 633 or 635 nm excitation ThermoFisher Scientific S34859
T4 DNA ligase New England BioLabs M0202S
T4 Polynucleotide Kinase New England BioLabs M0201S
Trypan Blue Solution, 0.4% ThermoFisher Scientific 15250061
Trypsin-EDTA solution (0.25%), with phenol red ThermoFisher Scientific 25200056
ZOE Fluorescent Cell Imager Bio-Rad
1.5 mL microtubes, PCR-clean Eppendorf, or similar 0030 125.215
24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates Corning 3524
96-well Clear Flat Bottom Polystyrene TC-treated Microplates Corning 3599
96-well Clear Round Bottom TC-treated Microplate Corning 3799
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Referências

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Zhang, L., Huang, R., Lu, L., Fu, R., Guo, G., Gu, Y., Liu, Z., He, L., Malissen, M., Liang, Y. Gene Knock-in by CRISPR/Cas9 and Cell Sorting in Macrophage and T Cell Lines. J. Vis. Exp. (177), e62328, doi:10.3791/62328 (2021).
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