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Abstract
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Tadução automática
Imunologia e Infecção

Gene Knock-in por CRISPR/Cas9 e Classificação celular em linhas de células macrófagos e t

Published: November 13, 2021
doi:
10.3791/62328
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1The Laboratory of Genetic Regulators in the Immune System, School of Laboratory Medicine,Xinxiang Medical University, 2Centre d’Immunologie de Marseille-Luminy,Aix Marseille Université

Summary

Este protocolo usa repórteres fluorescentes e classificação celular para simplificar experimentos de knock-in em linhas de células macrófagos e t. Dois plasmídeos são usados para esses experimentos simplificados de knock-in, ou seja, um plasmídeo de expressão CRISPR/Cas9 e DsRed2 e um plasmídeo de recombinação homólogo que expressa EBFP2, que está permanentemente integrado no lócus Rosa26 em células imunes.

Abstract

Estudos de genômica funcional do sistema imunológico requerem manipulações genéticas que envolvem tanto a exclusão de genes-alvo quanto a adição de elementos a proteínas de interesse. A identificação de funções genéticas em modelos de linha celular é importante para a descoberta genética e exploração de mecanismos intrínsecos. No entanto, as manipulações genéticas de células imunes, como células T e linhas de células macrófagos usando knock-in mediada por CRISPR/Cas9, são difíceis devido à baixa eficiência de transfecção dessas células, especialmente em um estado quiescente. Para modificar genes em células imunes, a seleção de resistência a drogas e vetores virais são tipicamente usados para enriquecer para células que expressam o sistema CRIPSR/Cas9, o que inevitavelmente resulta em intervenção indesejável das células. Em um estudo anterior, projetamos repórteres fluorescentes duplos acoplados ao CRISPR/Cas9 que foram transitoriamente expressos após a eletroporação. Esta solução técnica leva à rápida exclusão genética em células imunes; no entanto, o impacto genético em células imunes, como células T e macrófagos sem o uso de seleção de resistência a drogas ou vetores virais, é ainda mais desafiador. Neste artigo, mostramos que, usando a triagem celular para auxiliar a seleção de células que expressam transitoriamente as construções CRISPR/Cas9 visando o lócus Rosa26 em combinação com um plasmídeo doador, o knock-in genético pode ser alcançado tanto em células T quanto em macrófagos sem enriquecimento de resistência a drogas. Como exemplo, mostramos como expressar o ACE2 humano, um receptor de SARS-Cov-2, que é responsável pela atual pandemia Covid-19, em macrófagos RAW264.7 realizando experimentos knock-in. Tais células de impacto genéticos podem ser amplamente utilizadas para estudos mecanicistas.

Introduction

Células imunes são críticas para a defesa contra patógenos. Imunidade inata e adaptativa são necessárias para liberação de infectantes e manutenção da homeostasetecidual 1,2. Modelos de linha celular são ferramentas essenciais para a compreensão dos fundamentos moleculares do sistema imunológico dos mamíferos; são utilizados em ensaios funcionais in vitro, como aqueles modelando a ativação de células T humanas, e na determinação da função de fatores genéticos na ativação ou amortecimento das respostas imunes3,4. É importante notar que o sistema imunológico dos mamíferos é extremamente heterogêneo e, igualmente importante, um enorme número de moléculas controla a diferenciação, migração e função de uma determinada célula tipo5,6.

As ferramentas de edição de genomas curtas econsetos interespaçadas regularmente (CRISPR)/Cas9 permitem a manipulação genética de tipos de células específicas, o que facilita a anotação funcional de genes de forma precisa7,8. Vários protocolos publicados descreveram a entrega de CRISPR/Cas9 na forma de complexos de RNA de guia Cas9 conhecidos como ribonucleoproteínas (RNPs) em células HEK293, linhas celulares Jurkat, células T primárias9,10,macrófagos11,12,13, células-tronco14, e outras15,16. Nesses protocolos, a marcação genética geralmente é alcançada fundindo uma tag fluorescente às proteínas endógenas17,18. No entanto, poucas tentativas foram feitas para usar repórteres fluorescentes duplos, que são compatíveis com a classificação de células únicas, para facilitar experimentos de knock-in19,20, particularmente em células imunes.

Análises mecanicistas aprofundadas destinadas a entender as funções de um novo fator genético em células imunes geralmente requerem a exclusão específica do tipo celular de um gene, experimentos de resgate genético e ideal identificação de seus interagirores. Embora métodos de otimização da exclusão genética de genes em células imunes tenham sido publicados9,15,21, muito menos métodos foram relatados para introduzir alelos knock-in com funções versáteis para entender a resposta imune. Portanto, neste protocolo pretendemos descrever em detalhes um protocolo eficiente e altamente reprodutível para expressar uma proteína de interesse (POI) no lócus do porto seguro Rosa26 em linhas de células imunes humanas e murinas. Projetamos um sistema de repórter de duas cores para enriquecer para células transfeinadas com plasmídeos expressando CRISPR/Cas9 (DsRed2) e um modelo de DNA recombinante (EBFP2), que pode ser isolado por classificação celular. Seguindo este protocolo, obtivemos múltiplas linhas de knock-in da linha celular T humana Jurkat e macrófago murina RAW264.7 para análises funcionais de proteínas mal estudadas.

Como exemplo, mostramos neste protocolo como obter macrófagos RAW264.7 expressando compunção ace2 humano (receptor de SARS-Cov-2)22. Como as células imunes inatas estão envolvidas na patogênese do Covid-1923,24 e o ACE2 humano é considerado um receptor importante necessário para a entrada viral nas células antes da replicação, macrófagos com knock-in do ACE2 humano podem servir como uma ferramenta útil para estudos mecanicistas de multiplicação viral dentro de macrófagos. Em paralelo, também apresentamos um exemplo de knock-in de um gene no lócus ROSA26 humano para expressar a proteína RASGRP1, que foi fundida em seu amino terminus com uma afinidade Twin-Strep-tag (OST). As células T são células-alvo-chave em terapias imunológicas, e um número crescente de estudos tem se concentrado na manipulação de sua capacidade de resposta ao câncer25,26. Como rasgrp1 é conhecido por ser uma molécula-chave de sinalização a jusante do receptor de células T e seus interagirres não são bem elucidados27, o modelo de knock-in OST-RASGRP1 fornece a base para identificar interactores que regulam a resposta das células T a tumores e infecções. Juntas, essas ferramentas podem ser usadas para estudos covid-19 e a descoberta de novas moléculas interagindo com Rasgrp1.

Protocol

1. Projeto e Construção Plasmid de sgRNAs visando Rosa26 Locus Guia de design RNAs em torno do local de inserção desejado Certifique-se de que o local de inserção do mouse Rosa26 (doravante designado como mRosa26) esteja localizado no primeiro intron de mRosa26; este site foi utilizado em estudos anteriores28,29. Para experimentos em células humanas, certifique-se de …

Representative Results

Seguindo o protocolo descrito acima para realizar experimentos de knock-in no lócus mRosa26 usando macrófagos murine RAW264.7, projetamos um vetor direcionado para expressar ace2 humano, um receptor para o vírus SARS-Cov-2(Figura 2A). Usando um design semelhante, geramos células Tockat T humanas com knock-in da proteína de fusão RASGRP1 marcada pelo OST(Figura 2C). Após a transfecção de três plasmídeos, dois dos quais foram usados para expres…

Discussion

Em nossos experimentos, demonstramos como realizar a edição em células imunes desde o projeto de construção até a triagem e validação celular knock-in usando células toscos humanos e macrófagos murine RAW264.7 como exemplos. As linhas de células T e macrófagos são resistentes à transfecção36,37; no entanto, o problema da baixa eficiência da entrega do CRISPR/Cas9 pode ser superado com o auxílio de repórteres fluorescentes aliados à classifica?…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos a instalação do núcleo de citometria de fluxo da Universidade Médica de Xinxiang. O desenvolvimento dessa tecnologia tem sido apoiado por subvenções da NSFC 81601360 à LZ, 81471595 e 32070898 à YL. O trabalho também conta com o apoio da Fundação do Comitê Educacional henan nº 21IRTSTHN030.

Materials

Amersham Imager 600 Ge Healthcare imaging of chemiluminescence
Ampicillin, sodium salt MP Biomedicals 194526
Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody Cell Signaling Technology 7074 at 1/5000 dilution
Anti-RasGRP1 antibody, clone 10.1 Merck MABS146 1.0 μg/mL of working concentration
AscI New England BioLabs R0558S
β-Actin (D6A8) Rabbit mAb Cell Signaling Technology 8457 at 1/1000 dilution
BamHI-HF New England BioLabs R3136S
BbsI-HF New England BioLabs R3539S
Cellometer Mini Automated Cell Counter Nexcelom Bioscience
E.coli DH5α Competent Cells Takara 9057
DMSO (Dimethyl Sulfoxide) MP Biomedicals 196055
DNeasy Blood & Tissue Kits Qiagen 69506 cell culture reagent
DPBS (10X), no calcium, no magnesium ThermoFisher Scientific 14200075
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) with high glucose HyClone SH30022.01
EcoRI-HF New England BioLabs R3101S
FACSAria™ Fusion BD Biosciences equipped with biosafety cabinet
FACS Canto flow cytometer BD Biosciences
Falcon 5 ml polystyrene round bottom test tube BD Biosciences 352003
Fetal bovine serum (FBS) ThermoFisher Scientific 10099141
FlowJo version 10.7 BD Biosciences
GAPDH (D16H11) XP Rabbit mAb Cell Signaling Technology 5174 at 1/1000 dilution
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP ThermoFisher Scientific 31430 at 1/5000 dilution
Immobilon ECL Ultra Western HRP Substrate Millipore WBKLS0500
Immobilon-PSQ PVDF Membrane Millipore ISEQ00010
Jurkat ATCC TIB-152 https://www.atcc.org/
Kanamycin sulfate MP Biomedicals 194531
LB agar powder ThermoFisher Scientific 22700041
Multi-channel Pipette (30-300 μL) Eppendorf, or similar
Neon Transfection System ThermoFisher Scientific MPK5000
Neon Transfection System, 10 μL kit ThermoFisher Scientific MPK1096
Nunc 15 mL Conical Sterile Centrifuge Tubes ThermoFisher Scientific 339651
OneTaq® Hot Start Quick-Load® 2X Master Mix New England BioLabs (M0489) for high GC% template
PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa ThermoFisher Scientific 26616
Pipette tip 0.1-20µl Eppendorf, or similar 0030 075.005
Pipette tip 2-200µl Eppendorf, or similar 0030 075.021
Pipette tip 50-1000µl Eppendorf, or similar 0030 075.064
Plasmid Maxi Kit Qiagen 12163
pX458-DsRed2 Addgene 112219
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen 28104 purify plasmid from restriction digestion
Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix New England BioLabs M0494S
RAW264.7 ATCC TIB-71 https://www.atcc.org/
Recombinant Anti-ACE2 antibody [EPR4435(2)] Abcam ab108252 at 1/1000 dilution
RPMI 1640 Medium HyClone SH30027.01
Strep-Tactin Sepharose beads IBA Lifesciences 2-1201-010
Penicillin-Streptomycin ThermoFisher Scientific 15140122
SYTOX™ Red Dead Cell Stain, for 633 or 635 nm excitation ThermoFisher Scientific S34859
T4 DNA ligase New England BioLabs M0202S
T4 Polynucleotide Kinase New England BioLabs M0201S
Trypan Blue Solution, 0.4% ThermoFisher Scientific 15250061
Trypsin-EDTA solution (0.25%), with phenol red ThermoFisher Scientific 25200056
ZOE Fluorescent Cell Imager Bio-Rad
1.5 mL microtubes, PCR-clean Eppendorf, or similar 0030 125.215
24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates Corning 3524
96-well Clear Flat Bottom Polystyrene TC-treated Microplates Corning 3599
96-well Clear Round Bottom TC-treated Microplate Corning 3799
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Zhang, L., Huang, R., Lu, L., Fu, R., Guo, G., Gu, Y., Liu, Z., He, L., Malissen, M., Liang, Y. Gene Knock-in by CRISPR/Cas9 and Cell Sorting in Macrophage and T Cell Lines. J. Vis. Exp. (177), e62328, doi:10.3791/62328 (2021).
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