JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Tadução automática
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Imunologia e Infecção

Подделка генов с помощью CRISPR/Cas9 и сортировка клеток в макрофагах и Т-клеточных линиях

Published: November 13, 2021
doi:
10.3791/62328
, , , , , , , , ,
1The Laboratory of Genetic Regulators in the Immune System, School of Laboratory Medicine,Xinxiang Medical University, 2Centre d’Immunologie de Marseille-Luminy,Aix Marseille Université

Summary

Этот протокол использует флуоресцентные репортеры и сортировку клеток для упрощения экспериментов с подделкой в макрофагах и Т-клеточных линиях. Для этих упрощенных экспериментов используются две плазмиды, а именно CRISPR/Cas9- и DsRed2-экспрессивная плазмида и гомологичная рекомбинационная донорская плазмида, экспрессирующая EBFP2, которая постоянно интегрируется в локус Rosa26 в иммунных клетках.

Abstract

Исследования функциональной геномики иммунной системы требуют генетических манипуляций, которые включают как делецию генов-мишеней, так и добавление элементов к белкам, представляющим интерес. Идентификация функций генов в моделях клеточных линий важна для открытия генов и исследования клеточных механизмов. Тем не менее, генетические манипуляции с иммунными клетками, такими как Т-клетки и клеточные линии макрофагов, с использованием CRISPR / Cas9-опосредованного knock-in, затруднены из-за низкой эффективности трансфекции этих клеток, особенно в состоянии покоя. Для модификации генов в иммунных клетках отбор лекарственной устойчивости и вирусные векторы обычно используются для обогащения клеток, экспрессирующих систему CRIPSR / Cas9, что неизбежно приводит к нежелательному вмешательству клеток. В предыдущем исследовании мы разработали двойные флуоресцентные репортеры, соединенные с CRISPR / Cas9, которые были временно выражены после электропорации. Это техническое решение приводит к быстрой делеции генов в иммунных клетках; однако выбивание генов в иммунных клетках, таких как Т-клетки и макрофаги, без использования селекции лекарственной устойчивости или вирусных векторов является еще более сложной задачей. В этой статье мы показываем, что, используя сортировку клеток для облегчения отбора клеток, временно экспрессирующих конструкции CRISPR / Cas9, нацеленные на локус Rosa26 в сочетании с донорской плазмидой, выбивание гена может быть достигнуто как в Т-клетках, так и в макрофагах без обогащения лекарственной устойчивостью. В качестве примера мы показываем, как экспрессировать человеческий ACE2, рецептор SARS-Cov-2, который отвечает за текущую пандемию Covid-19, в макрофагах RAW264.7, проводя эксперименты. Такие генные клетки могут быть широко использованы для механистических исследований.

Introduction

Иммунные клетки имеют решающее значение для защиты от патогенов. Как врожденный, так и адаптивный иммунитет необходимы для клиренса инфекционных веществ и поддержания тканевого гомеостаза1,2. Модели клеточных линий являются важными инструментами для понимания молекулярных основ иммунной системы млекопитающих; они используются в функциональных анализах in vitro, таких как те, которые моделируют активацию Т-клеток человека, и в определении функции генетических факторов в активации или ослаблении иммунных реакций3,4. Важно отметить, что иммунная система млекопитающих чрезвычайно неоднородна и, что не менее важно, огромное количество молекул контролирует дифференцировку, миграцию и функцию данной клетки типа5,6.

Кластеризованные регулярно интерширидные короткие палиндромные повторы (CRISPR) / Cas9 инструменты редактирования генома позволяют проводить генетические манипуляции с конкретными типами клеток, что облегчает функциональную аннотацию генов точным образом7,8. Несколько опубликованных протоколов описали доставку CRISPR/Cas9 в виде Cas9-направляющих комплексов РНК, известных как рибонуклеопротеины (РНК) в клетках HEK293, клеточных линиях Юрката, первичных Т-клетках9,10,макрофагах11,12,13,стволовых клетках14и других15,16. В этих протоколах маркировка генов обычно достигается путем слияния флуоресцентной метки с эндогенными белками17,18. Однако было предпринято несколько попыток использовать двойные флуоресцентные репортеры, которые совместимы с сортировкой одиночных клеток, для облегчения экспериментов19,20,особенно в иммунных клетках.

Углубленный механистический анализ, направленный на понимание функций нового генетического фактора в иммунных клетках, обычно требует специфической делеции гена клеточного типа, генетических спасательных экспериментов и, в идеале, идентификации его интеракторов. Несмотря нато,что методы оптимизации генетической делеции генов в иммунных клетках были опубликованы9,15,21,было зарегистрировано гораздо меньше методов введения аллелей с универсальными функциями для понимания иммунного ответа. Поэтому в этом протоколе мы стремимся подробно описать эффективный и высоко воспроизводимый протокол для экспрессии интересующего белка (POI) в локусе безопасной гавани Rosa26 как в человеческих, так и в мышиных иммунных клеточных линиях. Мы разработали двухцветную репортерную систему для обогащения клеток, трансфектерированных плазмидами, экспрессирующими CRISPR/Cas9 (DsRed2) и рекомбинантным шаблоном ДНК (EBFP2), который может быть выделен путем сортировки клеток. Следуя этому протоколу, мы получили несколько линий Т-клеточной линии человека Jurkat и мышиного макрофага RAW264.7 для функционального анализа плохо изученных белков.

В качестве примера мы покажем в этом протоколе, как получить детонирующие макрофаги RAW264.7, стабильно экспрессирующие ACE2 человека (рецептор SARS-Cov-2)22. Поскольку врожденные иммунные клетки участвуют в патогенезе Covid-1923,24 и ace2 человека рассматривается как основной рецептор, необходимый для проникновения вируса в клетки перед репликацией, макрофаги с подделкой ACE2 человека могут служить полезным инструментом для механистических исследований размножения вируса внутри макрофагов. Параллельно мы также представляем пример выбивания гена в локусе ROSA26 человека для экспрессии белка RASGRP1, который был слит на его аминоце с аффинным Twin-Strep-tag (OST). Т-клетки являются ключевыми клетками-мишенями в иммунной терапии, и все большее число исследований сосредоточено на манипулировании их реакцией на рак25,26. Поскольку Rasgrp1, как известно, является ключевой сигнальной молекулой после рецептора Т-клеток, а его интеракторы недостаточно хорошо выяснены27,модель ОСТ-RASGRP1 обеспечивает основу для идентификации интеракторов, регулирующих реакцию Т-клеток на опухоли и инфекцию. Взятые вместе, эти инструменты могут быть использованы для исследований Covid-19 и открытия новых молекул, взаимодействующих с Rasgrp1.

Protocol

1. Проектирование и плазмидная конструкция sgRNAs, нацеленных на Локус Rosa26 Руководство по проектированию РНК вокруг желаемого места вставки Убедитесь, что место вставки для мыши Rosa26 (далее обозначается как mRosa26)для экспериментов с выбиванием рас…

Representative Results

Следуя описанному выше протоколу для проведения экспериментов в локусе mRosa26 с использованием мышиных макрофагов RAW264.7, мы разработали вектор нацеливания для экспрессии человеческого ACE2, рецептора для вируса SARS-Cov-2(рисунок 2A). Используя аналогичную конструкцию, мы с…

Discussion

В наших экспериментах мы продемонстрировали, как выполнять редактирование в иммунных клетках от конструкции до скрининга и валидации клеток с использованием человеческих Т-клеток Jurkat и мышиных макрофагов RAW264.7 в качестве примеров. Как Т-клеточные, так и макрофаговы клеточные линии уст…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы благодарим центр проточной цитометрии Медицинского университета Синьсян. Развитие такой технологии поддерживается грантами NSFC, 81601360 LZ, 81471595 и 32070898 YL. Работа также поддерживается Фондом Образовательного комитета Хэнань No 21IRTSTHN030.

Materials

Amersham Imager 600 Ge Healthcare imaging of chemiluminescence
Ampicillin, sodium salt MP Biomedicals 194526
Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody Cell Signaling Technology 7074 at 1/5000 dilution
Anti-RasGRP1 antibody, clone 10.1 Merck MABS146 1.0 μg/mL of working concentration
AscI New England BioLabs R0558S
β-Actin (D6A8) Rabbit mAb Cell Signaling Technology 8457 at 1/1000 dilution
BamHI-HF New England BioLabs R3136S
BbsI-HF New England BioLabs R3539S
Cellometer Mini Automated Cell Counter Nexcelom Bioscience
E.coli DH5α Competent Cells Takara 9057
DMSO (Dimethyl Sulfoxide) MP Biomedicals 196055
DNeasy Blood & Tissue Kits Qiagen 69506 cell culture reagent
DPBS (10X), no calcium, no magnesium ThermoFisher Scientific 14200075
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) with high glucose HyClone SH30022.01
EcoRI-HF New England BioLabs R3101S
FACSAria™ Fusion BD Biosciences equipped with biosafety cabinet
FACS Canto flow cytometer BD Biosciences
Falcon 5 ml polystyrene round bottom test tube BD Biosciences 352003
Fetal bovine serum (FBS) ThermoFisher Scientific 10099141
FlowJo version 10.7 BD Biosciences
GAPDH (D16H11) XP Rabbit mAb Cell Signaling Technology 5174 at 1/1000 dilution
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP ThermoFisher Scientific 31430 at 1/5000 dilution
Immobilon ECL Ultra Western HRP Substrate Millipore WBKLS0500
Immobilon-PSQ PVDF Membrane Millipore ISEQ00010
Jurkat ATCC TIB-152 https://www.atcc.org/
Kanamycin sulfate MP Biomedicals 194531
LB agar powder ThermoFisher Scientific 22700041
Multi-channel Pipette (30-300 μL) Eppendorf, or similar
Neon Transfection System ThermoFisher Scientific MPK5000
Neon Transfection System, 10 μL kit ThermoFisher Scientific MPK1096
Nunc 15 mL Conical Sterile Centrifuge Tubes ThermoFisher Scientific 339651
OneTaq® Hot Start Quick-Load® 2X Master Mix New England BioLabs (M0489) for high GC% template
PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa ThermoFisher Scientific 26616
Pipette tip 0.1-20µl Eppendorf, or similar 0030 075.005
Pipette tip 2-200µl Eppendorf, or similar 0030 075.021
Pipette tip 50-1000µl Eppendorf, or similar 0030 075.064
Plasmid Maxi Kit Qiagen 12163
pX458-DsRed2 Addgene 112219
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen 28104 purify plasmid from restriction digestion
Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix New England BioLabs M0494S
RAW264.7 ATCC TIB-71 https://www.atcc.org/
Recombinant Anti-ACE2 antibody [EPR4435(2)] Abcam ab108252 at 1/1000 dilution
RPMI 1640 Medium HyClone SH30027.01
Strep-Tactin Sepharose beads IBA Lifesciences 2-1201-010
Penicillin-Streptomycin ThermoFisher Scientific 15140122
SYTOX™ Red Dead Cell Stain, for 633 or 635 nm excitation ThermoFisher Scientific S34859
T4 DNA ligase New England BioLabs M0202S
T4 Polynucleotide Kinase New England BioLabs M0201S
Trypan Blue Solution, 0.4% ThermoFisher Scientific 15250061
Trypsin-EDTA solution (0.25%), with phenol red ThermoFisher Scientific 25200056
ZOE Fluorescent Cell Imager Bio-Rad
1.5 mL microtubes, PCR-clean Eppendorf, or similar 0030 125.215
24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates Corning 3524
96-well Clear Flat Bottom Polystyrene TC-treated Microplates Corning 3599
96-well Clear Round Bottom TC-treated Microplate Corning 3799
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Cronkite, D. A., Strutt, T. M. The Regulation of Inflammation by Innate and Adaptive Lymphocytes. Journal of Immunology Research. 2018, 1467538 (2018).
  2. Iwasaki, A., Medzhitov, R. Control of adaptive immunity by the innate immune system. Nature Immunology. 16 (4), 343-353 (2015).
  3. Chicaybam, L., et al. An Efficient Electroporation Protocol for the Genetic Modification of Mammalian Cells. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 99 (2016).
  4. Manguso, R. T., et al. In vivo CRISPR screening identifies Ptpn2 as a cancer immunotherapy target. Nature. 547 (7664), 413-418 (2017).
  5. Siggs, O. M. Dissecting mammalian immunity through mutation. Immunology and Cell Biology. 92 (5), 392-399 (2014).
  6. Satija, R., Shalek, A. K. Heterogeneity in immune responses: from populations to single cells. Trends in Immunology. 35 (5), 219-229 (2014).
  7. Shui, B., Hernandez Matias, L., Guo, Y., Peng, Y. The Rise of CRISPR/Cas for Genome Editing in Stem Cells. Stem Cells International. 2016, 8140168 (2016).
  8. Komor, A. C., Badran, A. H., Liu, D. R. CRISPR-Based Technologies for the Manipulation of Eukaryotic Genomes. Cell. 168 (1-2), 20-36 (2017).
  9. Seki, A., Rutz, S. Optimized RNP transfection for highly efficient CRISPR/Cas9-mediated gene knockout in primary T cells. Journal of Experimental Medicine. 215 (3), 985-997 (2018).
  10. Oh, S. A., Seki, A., Rutz, S. Ribonucleoprotein Transfection for CRISPR/Cas9-Mediated Gene Knockout in Primary T Cells. Current Protocols in Immunology. 124 (1), 69 (2019).
  11. Lee, Y. W., et al. In Vivo Editing of Macrophages through Systemic Delivery of CRISPR-Cas9-Ribonucleoprotein-Nanoparticle Nanoassemblies. Advances in Therapy (Weinh). 2 (10), (2019).
  12. Freund, E. C., et al. Efficient gene knockout in primary human and murine myeloid cells by non-viral delivery of CRISPR-Cas9. Journal of Experimental Medicine. 217 (7), (2020).
  13. Huang, R., et al. The three members of the Vav family proteins form complexes that concur to foam cell formation and atherosclerosis. Journal of Lipid Research. 60 (12), 2006-2019 (2019).
  14. Scharenberg, S. G., et al. Engineering monocyte/macrophage-specific glucocerebrosidase expression in human hematopoietic stem cells using genome editing. Nature Communications. 11 (1), 3327 (2020).
  15. Jacobi, A. M., et al. Simplified CRISPR tools for efficient genome editing and streamlined protocols for their delivery into mammalian cells and mouse zygotes. Methods. 121-122, 16-28 (2017).
  16. Liang, X., Potter, J., Kumar, S., Ravinder, N., Chesnut, J. D. Enhanced CRISPR/Cas9-mediated precise genome editing by improved design and delivery of gRNA, Cas9 nuclease, and donor DNA. Journal of Biotechnology. 241, 136-146 (2017).
  17. Haupt, A., Grancharova, T., Arakaki, J., Fuqua, M. A., Roberts, B., Gunawardane, R. N. Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9. Journal of Visualized Experiments. (138), (2018).
  18. Li, S., Xue, H., Long, B., Sun, L., Truong, T., Liu, Y. Efficient generation of hiPSC neural lineage specific knockin reporters using the CRISPR/Cas9 and Cas9 double nickase system. Journal of Visualized Experiments. (99), e52539 (2015).
  19. Schumann, K., et al. Generation of knock-in primary human T cells using Cas9 ribonucleoproteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (33), 10437-10442 (2015).
  20. Hamilton, J. R., et al. Targeted delivery of CRISPR-Cas9 and transgenes enables complex immune cell engineering. Cell Reports. 35 (9), 109207 (2021).
  21. Luo, J., et al. Speed genome editing by transient CRISPR/Cas9 targeting and large DNA fragment deletion. Journal of Biotechnology. 281, 11-20 (2018).
  22. Bourgonje, A. R., et al. Angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2), SARS-CoV-2 and the pathophysiology of coronavirus disease. Journal of Pathology. 251 (3), 228-248 (2020).
  23. Schultze, J. L., Aschenbrenner, A. C. COVID-19 and the human innate immune system. Cell. 184 (7), 1671-1692 (2021).
  24. Taefehshokr, N., Taefehshokr, S., Hemmat, N., Heit, B. Covid-19: Perspectives on Innate Immune Evasion. Frontiers in Immunology. 11 (2549), (2020).
  25. Waldman, A. D., Fritz, J. M., Lenardo, M. J. A guide to cancer immunotherapy: from T cell basic science to clinical practice. Nature Reviews: Immunology. 20 (11), 651-668 (2020).
  26. Chandran, S. S., Klebanoff, C. A. T cell receptor-based cancer immunotherapy: Emerging efficacy and pathways of resistance. Immunological Reviews. 290 (1), 127-147 (2019).
  27. Dower, N. A., et al. RasGRP is essential for mouse thymocyte differentiation and TCR signaling. Nature Immunology. 1 (4), 317-321 (2000).
  28. Soriano, P. Generalized lacZ expression with the ROSA26 Cre reporter strain. Nature Genetics. 21 (1), 70-71 (1999).
  29. Chu, V. T., et al. Efficient generation of Rosa26 knock-in mice using CRISPR/Cas9 in C57BL/6 zygotes. BMC Biotechnology. 16, 4 (2016).
  30. Irion, S., Luche, H., Gadue, P., Fehling, H. J., Kennedy, M., Keller, G. Identification and targeting of the ROSA26 locus in human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (12), 1477-1482 (2007).
  31. Concordet, J. -. P., Haeussler, M. CRISPOR: intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens. Nucleic Acids Research. 46, 242-245 (2018).
  32. Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biology. 17 (1), 148 (2016).
  33. Jang, D. E., et al. Multiple sgRNAs with overlapping sequences enhance CRISPR/Cas9-mediated knock-in efficiency. Experimental and Molecular Medicine. 50 (4), 1-9 (2018).
  34. Miura, H., Quadros, R. M., Gurumurthy, C. B., Ohtsuka, M. Easi-CRISPR for creating knock-in and conditional knockout mouse models using long ssDNA donors. Nature Protocols. 13 (1), 195-215 (2018).
  35. Paix, A., Rasoloson, D., Folkmann, A., Seydoux, G. Rapid Tagging of Human Proteins with Fluorescent Reporters by Genome Engineering using Double-Stranded DNA Donors. Current Protocols in Molecular Biology. 129 (1), 102 (2019).
  36. Ebert, O., et al. Lymphocyte apoptosis: induction by gene transfer techniques. Gene Therapy. 4 (4), 296-302 (1997).
  37. Zhang, X., Edwards, J. P., Mosser, D. M. The expression of exogenous genes in macrophages: obstacles and opportunities. Methods in Molecular Biology. 531, 123-143 (2009).
  38. Chu, V. T., et al. Efficient CRISPR-mediated mutagenesis in primary immune cells using CrispRGold and a C57BL/6 Cas9 transgenic mouse line. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (44), 12514-12519 (2016).
  39. Banan, M. Recent advances in CRISPR/Cas9-mediated knock-ins in mammalian cells. Journal of Biotechnology. 308, 1-9 (2020).
  40. Roberts, B., et al. Systematic gene tagging using CRISPR/Cas9 in human stem cells to illuminate cell organization. Molecular Biology of the Cell. 28 (21), 2854-2874 (2017).
  41. Bukhari, H., Müller, T. Endogenous Fluorescence Tagging by CRISPR. Trends in Cell Biology. 29 (11), 912-928 (2019).
  42. Koch, B., Nijmeijer, B., Kueblbeck, M., Cai, Y., Walther, N., Ellenberg, J. Generation and validation of homozygous fluorescent knock-in cells using CRISPR-Cas9 genome editing. Nature Protocols. 13 (6), 1465-1487 (2018).
  43. Abraham, R. T., Weiss, A. Jurkat T cells and development of the T-cell receptor signalling paradigm. Nature Reviews Immunology. 4 (4), 301-308 (2004).
  44. Freen-van Heeren, J. J. -., Popović, B., Guislain, A., Wolkers, M. C. Human T cells employ conserved AU-rich elements to fine-tune IFN-γ production. European Journal of Immunology. 50 (7), 949-958 (2020).
  45. Roncagalli, R., et al. The scaffolding function of the RLTPR protein explains its essential role for CD28 co-stimulation in mouse and human T cells. Journal of Experimental Medicine. 213 (11), 2437-2457 (2016).
  46. He, L., et al. ARHGAP45 controls naïve T- and B-cell entry into lymph nodes and T-cell progenitor thymus seeding. EMBO Reports. 22 (4), 52196 (2021).
  47. Sadelain, M., Papapetrou, E. P., Bushman, F. D. Safe harbours for the integration of new DNA in the human genome. Nature Reviews: Cancer. 12 (1), 51-58 (2011).
  48. Papapetrou, E. P., Gene Schambach, A. Insertion Into Genomic Safe Harbors for Human Gene Therapy. Molecular Therapy. 24 (4), 678-684 (2016).
  49. Wang, X., et al. A transgene-encoded cell surface polypeptide for selection, in vivo tracking, and ablation of engineered cells. Blood. 118 (5), 1255-1263 (2011).
  50. Eyquem, J., et al. Targeting a CAR to the TRAC locus with CRISPR/Cas9 enhances tumour rejection. Nature. 543 (7643), 113-117 (2017).

Tags

Keywords: CRISPR/Cas9Gene Knock-inMacrophageT Cell LinesROSA26 LocusSgRNA DesignHomologous RecombinationTargeting VectorFluorescent ReporterCell Sorting
check_url/pt/62328?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Zhang, L., Huang, R., Lu, L., Fu, R., Guo, G., Gu, Y., Liu, Z., He, L., Malissen, M., Liang, Y. Gene Knock-in by CRISPR/Cas9 and Cell Sorting in Macrophage and T Cell Lines. J. Vis. Exp. (177), e62328, doi:10.3791/62328 (2021).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image