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Imunologia e Infecção

Knock-in de genes por CRISPR/Cas9 y clasificación celular en líneas de macrófagos y células T

Published: November 13, 2021
doi:
10.3791/62328
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1The Laboratory of Genetic Regulators in the Immune System, School of Laboratory Medicine,Xinxiang Medical University, 2Centre d’Immunologie de Marseille-Luminy,Aix Marseille Université

Summary

Este protocolo utiliza reporteros fluorescentes y clasificación celular para simplificar los experimentos en cadena en líneas de macrófagos y células T. Se utilizan dos plásmidos para estos experimentos simplificados de knock-in, a saber, un plásmido que expresa CRISPR / Cas9 y DsRed2 y un plásmido donante de recombinación homóloga que expresa EBFP2, que se integra permanentemente en el locus Rosa26 en las células inmunes.

Abstract

Los estudios de genómica funcional del sistema inmune requieren manipulaciones genéticas que impliquen tanto la eliminación de genes diana como la adición de elementos a proteínas de interés. La identificación de las funciones génicas en modelos de líneas celulares es importante para el descubrimiento de genes y la exploración de los mecanismos intrínsecos de las células. Sin embargo, las manipulaciones genéticas de células inmunes como las células T y las líneas celulares de macrófagos utilizando knock-in mediado por CRISPR / Cas9 son difíciles debido a la baja eficiencia de transfección de estas células, especialmente en un estado de reposo. Para modificar los genes en las células inmunes, la selección de resistencia a los medicamentos y los vectores virales se utilizan típicamente para enriquecer a las células que expresan el sistema CRIPSR / Cas9, lo que inevitablemente resulta en una intervención indeseable de las células. En un estudio anterior, diseñamos reporteros fluorescentes duales acoplados a CRISPR / Cas9 que se expresaron transitoriamente después de la electroporación. Esta solución técnica conduce a la rápida deleción de genes en las células inmunes; sin embargo, la eliminación de genes en células inmunes como las células T y los macrófagos sin el uso de la selección de resistencia a los medicamentos o vectores virales es aún más desafiante. En este artículo, mostramos que mediante el uso de la clasificación celular para ayudar a la selección de células que expresan transitoriamente construcciones CRISPR / Cas9 dirigidas al locus Rosa26 en combinación con un plásmido donante, se puede lograr un knock-in de genes tanto en células T como en macrófagos sin enriquecimiento de resistencia a los medicamentos. Como ejemplo, mostramos cómo expresar ACE2 humano, un receptor del SARS-Cov-2, que es responsable de la actual pandemia de Covid-19, en macrófagos RAW264.7 mediante la realización de experimentos en cadena. Tales células de knock-in de genes pueden ser ampliamente utilizadas para estudios mecanicistas.

Introduction

Las células inmunes son críticas para la defensa contra los patógenos. Tanto la inmunidad innata como la adaptativa son necesarias para el aclaramiento de los infecciosos y el mantenimiento de la homeostasis tisular1,2. Los modelos de líneas celulares son herramientas esenciales para comprender los fundamentos moleculares del sistema inmune de los mamíferos; se utilizan en ensayos funcionales in vitro, como los que modelan la activación de células T humanas, y en la determinación de la función de los factores genéticos en la activación o amortiguación de las respuestas inmunes3,4. Es importante tener en cuenta que el sistema inmune de los mamíferos es enormemente heterogéneo y, lo que es igualmente importante, un gran número de moléculas controlan la diferenciación, la migración y la función de una célula determinada de tipo5,6.

Las herramientas de edición del genoma Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)/Cas9 permiten la manipulación genética de tipos celulares específicos, lo que facilita la anotación funcional de genes de manera precisa7,8. Varios protocolos publicados han descrito la entrega de CRISPR/Cas9 en forma de complejos de ARN guía Cas9 conocidos como ribonucleoproteínas (RNPs) en células HEK293, líneas celulares Jurkat, células T primarias9,10,macrófagos11,12,13,células madre14,y otras15,16. En estos protocolos, el etiquetado genético se suele conseguir fusionando una etiqueta fluorescente con proteínas endógenas17,18. Sin embargo, se han hecho pocos intentos de utilizar reporteros fluorescentes duales, que son compatibles con la clasificación de una sola célula, para facilitar los experimentos de knock-in19,20, particularmente en células inmunes.

Los análisis mecanicistas en profundidad destinados a comprender las funciones de un nuevo factor genético en las células inmunes generalmente requieren la eliminación específica del tipo celular de un gen, experimentos de rescate genético e idealmente la identificación de sus interactores. A pesar de que se han publicado métodos para la optimización de la deleción genética de genes en células inmunes9,15,21,se han reportado muchos menos métodos para introducir alelos en cadena con funciones versátiles para comprender la respuesta inmune. Por lo tanto, en este protocolo pretendemos describir en detalle un protocolo eficiente y altamente reproducible para expresar una proteína de interés (POI) en el locus de puerto seguro Rosa26 en líneas celulares inmunes humanas y murinas. Diseñamos un sistema reportero de dos colores para enriquecer las células transfectadas con plásmidos que expresan CRISPR/Cas9 (DsRed2) y una plantilla de ADN recombinante (EBFP2), que se puede aislar mediante clasificación celular. Siguiendo este protocolo, obtuvimos múltiples líneas knock-in de la línea de células T humanas Jurkat y el macrófago murino RAW264.7 para análisis funcionales de proteínas poco estudiadas.

A modo de ejemplo, mostramos en este protocolo cómo obtener macrófagos RAW264.7 que expresan de forma estable ace2 humana (un receptor del SARS-Cov-2)22. Debido a que las células inmunes innatas están involucradas en la patogénesis deCovid-19 23,24 y la ACE2 humana se considera un receptor importante requerido para la entrada viral en las células antes de la replicación, los macrófagos con knock-in de ACE2 humano pueden servir como una herramienta útil para estudios mecanicistas de multiplicación viral dentro de los macrófagos. Paralelamente, también presentamos un ejemplo de knock-in de un gen en el locus humano ROSA26 para expresar la proteína RASGRP1, que se fusionó en su extremo amino con una afinidad Twin-Strep-tag (OST). Las células T son células diana clave en las terapias inmunitarias, y un número creciente de estudios se han centrado en la manipulación de su capacidad de respuesta al cáncer25,26. Como se sabe que Rasgrp1 es una molécula de señalización clave aguas abajo del receptor de células T y sus interactores no están bien dilucidados27, el modelo de knock-in OST-RASGRP1 proporciona la base para identificar interactores que regulan la respuesta de las células T a los tumores y la infección. En conjunto, estas herramientas se pueden utilizar para estudios de Covid-19 y el descubrimiento de nuevas moléculas que interactúan con Rasgrp1.

Protocol

1. Diseño y construcción de plásmidos de sgRNAs dirigidos al locus Rosa26 Guía de diseño de ARN alrededor del sitio de inserción deseado Asegúrese de que el sitio de inserción para los experimentos de knock-in del ratón Rosa26 (en adelante designado como mRosa26)se encuentra en el primer intrón de mRosa26; este sitio ha sido utilizado en estudios previos28,29. Para…

Representative Results

Siguiendo el protocolo descrito anteriormente para realizar experimentos knock-in en el locus mRosa26 utilizando macrófagos murinos RAW264.7, diseñamos un vector dirigido para expresar ACE2 humano, un receptor para el virus SARS-Cov-2(Figura 2A). Usando un diseño similar, generamos células T Jurkat humanas con la entrada de la proteína de fusión RASGRP1 marcada con OST(Figura 2C). Después de la transfección de tres plásmidos, dos de los cuales …

Discussion

En nuestros experimentos, demostramos cómo realizar la edición en cadena en células inmunes desde el diseño de la construcción hasta la detección y validación de células en cadena utilizando células T Jurkat humanas y macrófagos murinos RAW264.7 como ejemplos. Tanto las líneas celulares de células T como las de macrófagos son resistentes a la transfección36,37; sin embargo, el problema de la baja eficiencia de la entrega de CRISPR / Cas9 se puede su…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos a la instalación central de citometría de flujo de la Universidad Médica de Xinxiang. El desarrollo de dicha tecnología ha sido apoyado por las subvenciones de NSFC 81601360 a LZ, 81471595 y 32070898 a YL. El trabajo también cuenta con el apoyo del Comité Educativo de la Fundación de Henan No. 21IRTSTHN030.

Materials

Amersham Imager 600 Ge Healthcare imaging of chemiluminescence
Ampicillin, sodium salt MP Biomedicals 194526
Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody Cell Signaling Technology 7074 at 1/5000 dilution
Anti-RasGRP1 antibody, clone 10.1 Merck MABS146 1.0 μg/mL of working concentration
AscI New England BioLabs R0558S
β-Actin (D6A8) Rabbit mAb Cell Signaling Technology 8457 at 1/1000 dilution
BamHI-HF New England BioLabs R3136S
BbsI-HF New England BioLabs R3539S
Cellometer Mini Automated Cell Counter Nexcelom Bioscience
E.coli DH5α Competent Cells Takara 9057
DMSO (Dimethyl Sulfoxide) MP Biomedicals 196055
DNeasy Blood & Tissue Kits Qiagen 69506 cell culture reagent
DPBS (10X), no calcium, no magnesium ThermoFisher Scientific 14200075
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) with high glucose HyClone SH30022.01
EcoRI-HF New England BioLabs R3101S
FACSAria™ Fusion BD Biosciences equipped with biosafety cabinet
FACS Canto flow cytometer BD Biosciences
Falcon 5 ml polystyrene round bottom test tube BD Biosciences 352003
Fetal bovine serum (FBS) ThermoFisher Scientific 10099141
FlowJo version 10.7 BD Biosciences
GAPDH (D16H11) XP Rabbit mAb Cell Signaling Technology 5174 at 1/1000 dilution
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP ThermoFisher Scientific 31430 at 1/5000 dilution
Immobilon ECL Ultra Western HRP Substrate Millipore WBKLS0500
Immobilon-PSQ PVDF Membrane Millipore ISEQ00010
Jurkat ATCC TIB-152 https://www.atcc.org/
Kanamycin sulfate MP Biomedicals 194531
LB agar powder ThermoFisher Scientific 22700041
Multi-channel Pipette (30-300 μL) Eppendorf, or similar
Neon Transfection System ThermoFisher Scientific MPK5000
Neon Transfection System, 10 μL kit ThermoFisher Scientific MPK1096
Nunc 15 mL Conical Sterile Centrifuge Tubes ThermoFisher Scientific 339651
OneTaq® Hot Start Quick-Load® 2X Master Mix New England BioLabs (M0489) for high GC% template
PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa ThermoFisher Scientific 26616
Pipette tip 0.1-20µl Eppendorf, or similar 0030 075.005
Pipette tip 2-200µl Eppendorf, or similar 0030 075.021
Pipette tip 50-1000µl Eppendorf, or similar 0030 075.064
Plasmid Maxi Kit Qiagen 12163
pX458-DsRed2 Addgene 112219
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen 28104 purify plasmid from restriction digestion
Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix New England BioLabs M0494S
RAW264.7 ATCC TIB-71 https://www.atcc.org/
Recombinant Anti-ACE2 antibody [EPR4435(2)] Abcam ab108252 at 1/1000 dilution
RPMI 1640 Medium HyClone SH30027.01
Strep-Tactin Sepharose beads IBA Lifesciences 2-1201-010
Penicillin-Streptomycin ThermoFisher Scientific 15140122
SYTOX™ Red Dead Cell Stain, for 633 or 635 nm excitation ThermoFisher Scientific S34859
T4 DNA ligase New England BioLabs M0202S
T4 Polynucleotide Kinase New England BioLabs M0201S
Trypan Blue Solution, 0.4% ThermoFisher Scientific 15250061
Trypsin-EDTA solution (0.25%), with phenol red ThermoFisher Scientific 25200056
ZOE Fluorescent Cell Imager Bio-Rad
1.5 mL microtubes, PCR-clean Eppendorf, or similar 0030 125.215
24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates Corning 3524
96-well Clear Flat Bottom Polystyrene TC-treated Microplates Corning 3599
96-well Clear Round Bottom TC-treated Microplate Corning 3799
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Referências

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Zhang, L., Huang, R., Lu, L., Fu, R., Guo, G., Gu, Y., Liu, Z., He, L., Malissen, M., Liang, Y. Gene Knock-in by CRISPR/Cas9 and Cell Sorting in Macrophage and T Cell Lines. J. Vis. Exp. (177), e62328, doi:10.3791/62328 (2021).
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