JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Tadução automática
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Imunologia e Infecção

MACROPHAGE ve T Hücre Hatlarında CRISPR/Cas9 ve Hücre Sıralama tarafından Gen Knock-in

Published: November 13, 2021
doi:
10.3791/62328
, , , , , , , , ,
1The Laboratory of Genetic Regulators in the Immune System, School of Laboratory Medicine,Xinxiang Medical University, 2Centre d’Immunologie de Marseille-Luminy,Aix Marseille Université

Summary

Bu protokol, makrofaj ve T hücre satırlarındaki darbe denemelerini basitleştirmek için floresan muhabirleri ve hücre sıralamasını kullanır. Bu basitleştirilmiş knock-in deneyleri için iki plazmid kullanılır, yani CRISPR / Cas9- ve DsRed2 ifade eden plazmid ve bağışıklık hücrelerindeki Rosa26 lokusunda kalıcı olarak entegre edilen EBFP2’yi ifade eden homolog bir rekombinasyon donör plazmid.

Abstract

Bağışıklık sisteminin fonksiyonel genomik çalışmaları, hem hedef genlerin silinmesini hem de elementlerin ilgi çekici proteinlere eklenmesini içeren genetik manipülasyonlar gerektirir. Hücre hattı modellerinde gen fonksiyonlarının tanımlanması, gen keşfi ve hücre içi mekanizmaların araştırılması için önemlidir. Bununla birlikte, CRISPR/Cas9 aracılı darbe kullanan T hücreleri ve makrofaj hücre hatları gibi bağışıklık hücrelerinin genetik manipülasyonları, özellikle sessiz bir durumda, bu hücrelerin düşük transfeksiyon verimliliği nedeniyle zordur. Bağışıklık hücrelerindeki genleri değiştirmek için, ilaç direnci seçimi ve viral vektörler tipik olarak CRIPSR/Cas9 sistemini ifade eden hücreler için zenginleştirmek için kullanılır ve bu da kaçınılmaz olarak hücrelerin istenmeyen müdahalesiyle sonuçlanır. Daha önceki bir çalışmada, CRISPR/Cas9 ile birleştiğinde elektroporasyondan sonra geçici olarak ifade edilen çift floresan muhabir tasarladık. Bu teknik çözüm bağışıklık hücrelerinde hızlı gen silinmesine yol açar; bununla birlikte, T hücreleri ve makrofajlar gibi bağışıklık hücrelerinde ilaç direnci seçimi veya viral vektörler kullanmadan gen darbesi daha da zordur. Bu yazıda, Rosa26 lokusunu hedef alan CRISPR/Cas9 yapılarını donör plazmid ile birlikte geçici olarak ifade eden hücrelerin seçimine yardımcı olmak için hücre sıralamasını kullanarak, ilaç direnci zenginleştirmesi olmadan hem T hücrelerinde hem de makrofajlarda gen darbesi elde edilebileceğini gösteriyoruz. Örnek olarak, mevcut Covid-19 salgınından sorumlu sars-Cov-2’nin bir reseptörü olan insan ACE2’nin RAW264.7 makrofajlarında nasıl ifade edilebilir olduğunu, darbe deneyleri yaparak gösteriyoruz. Bu tür gen darbeli hücreler mekanistik çalışmalar için yaygın olarak kullanılabilir.

Introduction

Bağışıklık hücreleri patojenlere karşı savunma için kritik öneme sahiptir. Enfekte edicilerin temizlenmesi ve doku homeostazının bakımı için hem doğuştan gelen hem de uyarlanabilir bağışıklık gereklidir1,2. Hücre hattı modelleri, memeli bağışıklık sisteminin moleküler temellerini anlamak için temel araçlardır; insan T hücre aktivasyonunu modellemek gibi in vitro fonksiyonel tahlillerde ve immün yanıtların etkinleştirilmesinde veya sönümlemesinde genetik faktörlerin işlevinin belirlenmesinde kullanılırlar3,4. Memeli bağışıklık sisteminin son derece heterojen olduğunu ve aynı derecede önemli olan çok sayıda molekülün belirli bir hücre tipinin farklılaşmasını, göçlerini ve işlevini kontrol ettiğini belirtmek önemlidir5,6.

Kümelenmiş Düzenli Aralıklı Kısa Palindromik Tekrarlar (CRISPR)/Cas9 genom düzenleme araçları, genlerin kesin bir şekilde fonksiyonel ek açıklamalarını kolaylaştıran belirli hücre türlerinin genetik manipülasyonuna izin verir7,8. Yayınlanan birkaç protokol, CRISPR/Cas9’un HEK293 hücrelerinde ribonükleoproteinler (RNP’ ler) olarak bilinen Cas9 kılavuzlu RNA kompleksleri, Jurkat hücre hatları, birincil T hücreleri9,10,makrofajlar11 , 12,13,kök hücreler 14 ve diğerleri15,16şeklinde teslimini tanımlamıştır. Bu protokollerde, gen etiketleme genellikle bir floresan etiketin endojen proteinlere kaynaştırılmasıyla elde edilir17,18. Bununla birlikte, özellikle bağışıklık hücrelerinde19,20darbeli deneyleri kolaylaştırmak için tek hücre sıralama ile uyumlu çift floresan muhabir kullanmak için çok az girişimde bulunulmuştır.

Yeni bir genetik faktörün bağışıklık hücrelerindeki işlevlerini anlamayı amaçlayan derinlemesine mekanistik analizler genellikle bir genin hücre tipi spesifik silinmesini, genetik kurtarma deneylerini ve etkileşimcilerinin ideal olarak tanımlanmasını gerektirir. İmmün hücrelerdeki genlerin genetik olarak silinmesinin optimizasyonu için yöntemler yayınlanmış olsa da, bağışıklık yanıtını anlamak için çok yönlü işlevlere sahip darbe alellerinin tanıtılması için9, 15,21, çok daha az yöntem bildirilmiştir. Bu nedenle, bu protokolde, hem insan hem de murine bağışıklık hücresi hatlarında güvenli liman locus Rosa26’da bir ilgi proteinini (POI) ifade etmek için verimli ve yüksek oranda tekrarlanabilir bir protokolü ayrıntılı olarak tanımlamayı amaçlıyoruz. CRISPR/Cas9 (DsRed2) ifade eden plazmidlerle enfekte olmuş hücreler için zenginleştirmek için iki renkli bir muhabir sistemi ve hücre sıralama ile izole edilebilen bir rekombinant DNA şablonu (EBFP2) tasarladık. Bu protokolün ardından, kötü çalışılmış proteinlerin fonksiyonel analizleri için insan T hücre hattı Jurkat ve murine makrofaj RAW264.7’nin birden fazla darbe hattını elde ettik.

Örnek olarak, bu protokolde insan ACE2 ‘yi (SARS-Cov-2 reseptörü) 22’yi kasten ifade edenRAW264.7 makrofajlarının nasıl elde edeceğimizi gösteriyoruz. Doğuştan gelen bağışıklık hücreleri Covid-19 23 ,24 patogenezinde yer aldığı ve insan ACE2’nin replikasyondan önce hücrelere viral giriş için gerekli olan önemli bir reseptör olarak kabul edildiği için, insan ACE2’nin darbe aldığı makrofajlar, makrofajların içindeki viral çarpmanın mekanistik çalışmaları için yararlı bir araç olarak hizmet edebilir. Buna paralel olarak, amino terminusunda Twin-Strep-tag (OST) benzeşimi ile kaynaşmış rasgrp1 proteinini ifade etmek için insan ROSA26 lokusunda bir genin çalınmasının bir örneğini de sunuyoruz. T hücreleri immün tedavilerde temel hedef hücrelerdir ve giderek artan sayıda çalışma kansere yanıt vermelerinin manipülasyonu üzerine odaklanmıştır25,26. Rasgrp1’in T hücre reseptörünün aşağı doğru önemli bir sinyal molekülü olduğu bilindiğinden ve etkileşimcileri iyi aydınlatılmamıştır27, OST-RASGRP1 knock-in modeli, T hücrelerinin tümörlere ve enfeksiyona tepkisini düzenleyen etkileşimcileri tanımlamak için temel sağlar. Birlikte ele alındığında, bu araçlar Covid-19 çalışmaları ve Rasgrp1 ile etkileşime giren yeni moleküllerin keşfi için kullanılabilir.

Protocol

1. Rosa26 Locus’u Hedefleyen sgRNA’ların Tasarımı ve Plazmid İnşaatı İstenilen ekleme sitesinin etrafında tasarım kılavuzu RNA’ları Fare Rosa26 için ekleme sitesinin (bundan böyle mRosa26olarak belirlenmiştir) çalma deneylerinin mRosa26’nınilk intronunda bulunduğundan emin olun; bu site önceki çalışmalarda kullanılmıştır28,29. İnsan hücrelerinde da…

Representative Results

Yukarıda açıklanan protokolün ardından murine RAW264.7 makrofajlarını kullanarak mRosa26 lokusunda darbe deneyleri yapmak için SARS-Cov-2 virüsü için bir reseptör olan insan ACE2’yi ifade etmek için bir hedefleme vektörü tasarladık (Şekil 2A). Benzer bir tasarım kullanarak, OST etiketli RASGRP1 füzyon proteininin(Şekil 2C)çalınmasıyla insan Jurkat T hücreleri oluşturduk. crispr/cas9 (DsRed2; pDsR-mR26-sg1 ve mRosa26 kno…

Discussion

Deneylerimizde, örnek olarak insan Jurkat T hücreleri ve murine RAW264.7 makrofajlarını kullanarak yapı tasarımından knock-in hücre taramasına ve doğrulamasına kadar bağışıklık hücrelerinde nasıl knock-in düzenlemenin gerçekleştirildiğini gösterdik. Hem T hücresi hem de makrofaj hücre hatları transfection36,37’yekarşı dirençlidir; bununla birlikte, CRISPR/Cas9 teslimatının düşük verimlilik sorunu, hücre sıralama ile birlikte fl…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Xinxiang Tıp Üniversitesi’nin akış sitometri çekirdek tesisine teşekkür ederiz. Bu teknolojinin geliştirilmesi, NSFC’nin LZ, 81471595 ve 32070898 YL’ye 81601360 vermesiyle desteklenmiştir. Çalışma ayrıca 21IRTSTHN030 sayılı Henan Eğitim Komitesi Vakfı tarafından da desteklenmektedir.

Materials

Amersham Imager 600 Ge Healthcare imaging of chemiluminescence
Ampicillin, sodium salt MP Biomedicals 194526
Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody Cell Signaling Technology 7074 at 1/5000 dilution
Anti-RasGRP1 antibody, clone 10.1 Merck MABS146 1.0 μg/mL of working concentration
AscI New England BioLabs R0558S
β-Actin (D6A8) Rabbit mAb Cell Signaling Technology 8457 at 1/1000 dilution
BamHI-HF New England BioLabs R3136S
BbsI-HF New England BioLabs R3539S
Cellometer Mini Automated Cell Counter Nexcelom Bioscience
E.coli DH5α Competent Cells Takara 9057
DMSO (Dimethyl Sulfoxide) MP Biomedicals 196055
DNeasy Blood & Tissue Kits Qiagen 69506 cell culture reagent
DPBS (10X), no calcium, no magnesium ThermoFisher Scientific 14200075
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) with high glucose HyClone SH30022.01
EcoRI-HF New England BioLabs R3101S
FACSAria™ Fusion BD Biosciences equipped with biosafety cabinet
FACS Canto flow cytometer BD Biosciences
Falcon 5 ml polystyrene round bottom test tube BD Biosciences 352003
Fetal bovine serum (FBS) ThermoFisher Scientific 10099141
FlowJo version 10.7 BD Biosciences
GAPDH (D16H11) XP Rabbit mAb Cell Signaling Technology 5174 at 1/1000 dilution
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP ThermoFisher Scientific 31430 at 1/5000 dilution
Immobilon ECL Ultra Western HRP Substrate Millipore WBKLS0500
Immobilon-PSQ PVDF Membrane Millipore ISEQ00010
Jurkat ATCC TIB-152 https://www.atcc.org/
Kanamycin sulfate MP Biomedicals 194531
LB agar powder ThermoFisher Scientific 22700041
Multi-channel Pipette (30-300 μL) Eppendorf, or similar
Neon Transfection System ThermoFisher Scientific MPK5000
Neon Transfection System, 10 μL kit ThermoFisher Scientific MPK1096
Nunc 15 mL Conical Sterile Centrifuge Tubes ThermoFisher Scientific 339651
OneTaq® Hot Start Quick-Load® 2X Master Mix New England BioLabs (M0489) for high GC% template
PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa ThermoFisher Scientific 26616
Pipette tip 0.1-20µl Eppendorf, or similar 0030 075.005
Pipette tip 2-200µl Eppendorf, or similar 0030 075.021
Pipette tip 50-1000µl Eppendorf, or similar 0030 075.064
Plasmid Maxi Kit Qiagen 12163
pX458-DsRed2 Addgene 112219
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen 28104 purify plasmid from restriction digestion
Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix New England BioLabs M0494S
RAW264.7 ATCC TIB-71 https://www.atcc.org/
Recombinant Anti-ACE2 antibody [EPR4435(2)] Abcam ab108252 at 1/1000 dilution
RPMI 1640 Medium HyClone SH30027.01
Strep-Tactin Sepharose beads IBA Lifesciences 2-1201-010
Penicillin-Streptomycin ThermoFisher Scientific 15140122
SYTOX™ Red Dead Cell Stain, for 633 or 635 nm excitation ThermoFisher Scientific S34859
T4 DNA ligase New England BioLabs M0202S
T4 Polynucleotide Kinase New England BioLabs M0201S
Trypan Blue Solution, 0.4% ThermoFisher Scientific 15250061
Trypsin-EDTA solution (0.25%), with phenol red ThermoFisher Scientific 25200056
ZOE Fluorescent Cell Imager Bio-Rad
1.5 mL microtubes, PCR-clean Eppendorf, or similar 0030 125.215
24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates Corning 3524
96-well Clear Flat Bottom Polystyrene TC-treated Microplates Corning 3599
96-well Clear Round Bottom TC-treated Microplate Corning 3799
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Cronkite, D. A., Strutt, T. M. The Regulation of Inflammation by Innate and Adaptive Lymphocytes. Journal of Immunology Research. 2018, 1467538 (2018).
  2. Iwasaki, A., Medzhitov, R. Control of adaptive immunity by the innate immune system. Nature Immunology. 16 (4), 343-353 (2015).
  3. Chicaybam, L., et al. An Efficient Electroporation Protocol for the Genetic Modification of Mammalian Cells. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 99 (2016).
  4. Manguso, R. T., et al. In vivo CRISPR screening identifies Ptpn2 as a cancer immunotherapy target. Nature. 547 (7664), 413-418 (2017).
  5. Siggs, O. M. Dissecting mammalian immunity through mutation. Immunology and Cell Biology. 92 (5), 392-399 (2014).
  6. Satija, R., Shalek, A. K. Heterogeneity in immune responses: from populations to single cells. Trends in Immunology. 35 (5), 219-229 (2014).
  7. Shui, B., Hernandez Matias, L., Guo, Y., Peng, Y. The Rise of CRISPR/Cas for Genome Editing in Stem Cells. Stem Cells International. 2016, 8140168 (2016).
  8. Komor, A. C., Badran, A. H., Liu, D. R. CRISPR-Based Technologies for the Manipulation of Eukaryotic Genomes. Cell. 168 (1-2), 20-36 (2017).
  9. Seki, A., Rutz, S. Optimized RNP transfection for highly efficient CRISPR/Cas9-mediated gene knockout in primary T cells. Journal of Experimental Medicine. 215 (3), 985-997 (2018).
  10. Oh, S. A., Seki, A., Rutz, S. Ribonucleoprotein Transfection for CRISPR/Cas9-Mediated Gene Knockout in Primary T Cells. Current Protocols in Immunology. 124 (1), 69 (2019).
  11. Lee, Y. W., et al. In Vivo Editing of Macrophages through Systemic Delivery of CRISPR-Cas9-Ribonucleoprotein-Nanoparticle Nanoassemblies. Advances in Therapy (Weinh). 2 (10), (2019).
  12. Freund, E. C., et al. Efficient gene knockout in primary human and murine myeloid cells by non-viral delivery of CRISPR-Cas9. Journal of Experimental Medicine. 217 (7), (2020).
  13. Huang, R., et al. The three members of the Vav family proteins form complexes that concur to foam cell formation and atherosclerosis. Journal of Lipid Research. 60 (12), 2006-2019 (2019).
  14. Scharenberg, S. G., et al. Engineering monocyte/macrophage-specific glucocerebrosidase expression in human hematopoietic stem cells using genome editing. Nature Communications. 11 (1), 3327 (2020).
  15. Jacobi, A. M., et al. Simplified CRISPR tools for efficient genome editing and streamlined protocols for their delivery into mammalian cells and mouse zygotes. Methods. 121-122, 16-28 (2017).
  16. Liang, X., Potter, J., Kumar, S., Ravinder, N., Chesnut, J. D. Enhanced CRISPR/Cas9-mediated precise genome editing by improved design and delivery of gRNA, Cas9 nuclease, and donor DNA. Journal of Biotechnology. 241, 136-146 (2017).
  17. Haupt, A., Grancharova, T., Arakaki, J., Fuqua, M. A., Roberts, B., Gunawardane, R. N. Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9. Journal of Visualized Experiments. (138), (2018).
  18. Li, S., Xue, H., Long, B., Sun, L., Truong, T., Liu, Y. Efficient generation of hiPSC neural lineage specific knockin reporters using the CRISPR/Cas9 and Cas9 double nickase system. Journal of Visualized Experiments. (99), e52539 (2015).
  19. Schumann, K., et al. Generation of knock-in primary human T cells using Cas9 ribonucleoproteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (33), 10437-10442 (2015).
  20. Hamilton, J. R., et al. Targeted delivery of CRISPR-Cas9 and transgenes enables complex immune cell engineering. Cell Reports. 35 (9), 109207 (2021).
  21. Luo, J., et al. Speed genome editing by transient CRISPR/Cas9 targeting and large DNA fragment deletion. Journal of Biotechnology. 281, 11-20 (2018).
  22. Bourgonje, A. R., et al. Angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2), SARS-CoV-2 and the pathophysiology of coronavirus disease. Journal of Pathology. 251 (3), 228-248 (2020).
  23. Schultze, J. L., Aschenbrenner, A. C. COVID-19 and the human innate immune system. Cell. 184 (7), 1671-1692 (2021).
  24. Taefehshokr, N., Taefehshokr, S., Hemmat, N., Heit, B. Covid-19: Perspectives on Innate Immune Evasion. Frontiers in Immunology. 11 (2549), (2020).
  25. Waldman, A. D., Fritz, J. M., Lenardo, M. J. A guide to cancer immunotherapy: from T cell basic science to clinical practice. Nature Reviews: Immunology. 20 (11), 651-668 (2020).
  26. Chandran, S. S., Klebanoff, C. A. T cell receptor-based cancer immunotherapy: Emerging efficacy and pathways of resistance. Immunological Reviews. 290 (1), 127-147 (2019).
  27. Dower, N. A., et al. RasGRP is essential for mouse thymocyte differentiation and TCR signaling. Nature Immunology. 1 (4), 317-321 (2000).
  28. Soriano, P. Generalized lacZ expression with the ROSA26 Cre reporter strain. Nature Genetics. 21 (1), 70-71 (1999).
  29. Chu, V. T., et al. Efficient generation of Rosa26 knock-in mice using CRISPR/Cas9 in C57BL/6 zygotes. BMC Biotechnology. 16, 4 (2016).
  30. Irion, S., Luche, H., Gadue, P., Fehling, H. J., Kennedy, M., Keller, G. Identification and targeting of the ROSA26 locus in human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (12), 1477-1482 (2007).
  31. Concordet, J. -. P., Haeussler, M. CRISPOR: intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens. Nucleic Acids Research. 46, 242-245 (2018).
  32. Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biology. 17 (1), 148 (2016).
  33. Jang, D. E., et al. Multiple sgRNAs with overlapping sequences enhance CRISPR/Cas9-mediated knock-in efficiency. Experimental and Molecular Medicine. 50 (4), 1-9 (2018).
  34. Miura, H., Quadros, R. M., Gurumurthy, C. B., Ohtsuka, M. Easi-CRISPR for creating knock-in and conditional knockout mouse models using long ssDNA donors. Nature Protocols. 13 (1), 195-215 (2018).
  35. Paix, A., Rasoloson, D., Folkmann, A., Seydoux, G. Rapid Tagging of Human Proteins with Fluorescent Reporters by Genome Engineering using Double-Stranded DNA Donors. Current Protocols in Molecular Biology. 129 (1), 102 (2019).
  36. Ebert, O., et al. Lymphocyte apoptosis: induction by gene transfer techniques. Gene Therapy. 4 (4), 296-302 (1997).
  37. Zhang, X., Edwards, J. P., Mosser, D. M. The expression of exogenous genes in macrophages: obstacles and opportunities. Methods in Molecular Biology. 531, 123-143 (2009).
  38. Chu, V. T., et al. Efficient CRISPR-mediated mutagenesis in primary immune cells using CrispRGold and a C57BL/6 Cas9 transgenic mouse line. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (44), 12514-12519 (2016).
  39. Banan, M. Recent advances in CRISPR/Cas9-mediated knock-ins in mammalian cells. Journal of Biotechnology. 308, 1-9 (2020).
  40. Roberts, B., et al. Systematic gene tagging using CRISPR/Cas9 in human stem cells to illuminate cell organization. Molecular Biology of the Cell. 28 (21), 2854-2874 (2017).
  41. Bukhari, H., Müller, T. Endogenous Fluorescence Tagging by CRISPR. Trends in Cell Biology. 29 (11), 912-928 (2019).
  42. Koch, B., Nijmeijer, B., Kueblbeck, M., Cai, Y., Walther, N., Ellenberg, J. Generation and validation of homozygous fluorescent knock-in cells using CRISPR-Cas9 genome editing. Nature Protocols. 13 (6), 1465-1487 (2018).
  43. Abraham, R. T., Weiss, A. Jurkat T cells and development of the T-cell receptor signalling paradigm. Nature Reviews Immunology. 4 (4), 301-308 (2004).
  44. Freen-van Heeren, J. J. -., Popović, B., Guislain, A., Wolkers, M. C. Human T cells employ conserved AU-rich elements to fine-tune IFN-γ production. European Journal of Immunology. 50 (7), 949-958 (2020).
  45. Roncagalli, R., et al. The scaffolding function of the RLTPR protein explains its essential role for CD28 co-stimulation in mouse and human T cells. Journal of Experimental Medicine. 213 (11), 2437-2457 (2016).
  46. He, L., et al. ARHGAP45 controls naïve T- and B-cell entry into lymph nodes and T-cell progenitor thymus seeding. EMBO Reports. 22 (4), 52196 (2021).
  47. Sadelain, M., Papapetrou, E. P., Bushman, F. D. Safe harbours for the integration of new DNA in the human genome. Nature Reviews: Cancer. 12 (1), 51-58 (2011).
  48. Papapetrou, E. P., Gene Schambach, A. Insertion Into Genomic Safe Harbors for Human Gene Therapy. Molecular Therapy. 24 (4), 678-684 (2016).
  49. Wang, X., et al. A transgene-encoded cell surface polypeptide for selection, in vivo tracking, and ablation of engineered cells. Blood. 118 (5), 1255-1263 (2011).
  50. Eyquem, J., et al. Targeting a CAR to the TRAC locus with CRISPR/Cas9 enhances tumour rejection. Nature. 543 (7643), 113-117 (2017).

Tags

Keywords: CRISPR/Cas9Gene Knock-inMacrophageT Cell LinesROSA26 LocusSgRNA DesignHomologous RecombinationTargeting VectorFluorescent ReporterCell Sorting
check_url/pt/62328?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Zhang, L., Huang, R., Lu, L., Fu, R., Guo, G., Gu, Y., Liu, Z., He, L., Malissen, M., Liang, Y. Gene Knock-in by CRISPR/Cas9 and Cell Sorting in Macrophage and T Cell Lines. J. Vis. Exp. (177), e62328, doi:10.3791/62328 (2021).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image