Linhas celulares tumorais circulantes: uma ferramenta inovadora para pesquisa fundamental e translacional

Resumo

Os CTCs de cultivo permitem uma caracterização funcional mais profunda do câncer, através do ensaio de expressão específica do marcador, e da avaliação da resistência medicamentosa e da capacidade de colonizar o fígado entre outras possibilidades. No geral, a cultura CTC pode ser uma ferramenta clínica promissora para a medicina personalizada para melhorar o resultado do paciente.

Resumo

A metástase é a principal causa de morte por câncer. Apesar da melhora nas estratégias de tratamento, o câncer metastático tem um prognóstico ruim. Enfrentamos, portanto, uma necessidade urgente de compreender os mecanismos por trás do desenvolvimento da metástase e, assim, propor tratamentos eficientes para o câncer avançado. Cânceres metastáticos são difíceis de tratar, pois biópsias são invasivas e inacessíveis. Recentemente, houve um interesse considerável em biópsias líquidas, incluindo o ácido desoxiribonucleico circulante livre de células (DNA) e as células tumorais circulantes do sangue periférico e estabelecemos várias linhas de células tumorais circulantes de pacientes com câncer colorretal metastático para participar de sua caracterização. De fato, para caracterizar funcionalmente essas células raras e mal descritas, o passo crucial é expandi-las. Uma vez estabelecidas, as linhas de células tumorais circulantes (CTC) podem então ser cultivadas em condições de suspensão ou aderentes. No nível molecular, as linhas CTC podem ser utilizadas para avaliar a expressão de marcadores específicos de interesse (como diferenciação, células-tronco epiteliais ou cancerígenas) por imunofluorescência ou análise de citometria. Além disso, as linhas CTC podem ser usadas para avaliar a sensibilidade medicamentosa a quimioterapias padrão-ouro, bem como a terapias-alvo. A capacidade das linhas CTC para iniciar tumores também pode ser testada por injeção subcutânea de CTCs em camundongos imunodeficientes.

Finalmente, é possível testar o papel de genes específicos de interesse que possam estar envolvidos na disseminação do câncer editando genes CTC, por ácido ribonucleico de pinos curtos (shRNA) ou Crispr/Cas9. Os CTCs modificados podem, assim, ser injetados em baços de camundongos imunodeficientes, para imitar experimentalmente parte do processo de desenvolvimento metastático in vivo.

Em conclusão, as linhas CTC são uma ferramenta preciosa para futuras pesquisas e para medicina personalizada, onde permitirão a previsão da eficiência do tratamento utilizando as próprias células que são originalmente responsáveis pela metástase.

Introdução

Apesar das recentes melhoras no diagnóstico precoce do câncer e na estratégia terapêutica, mais de noventa por cento da morbidade do câncer ainda se deve à metástase¹. O processo metastático é uma cascata de várias etapas que começa com o descolamento local das células do tumor primário e sua entrada na corrente sanguínea onde se tornam células tumorais circulantes (CTCs) para finalmente colonizar locais distantes como fígado e pulmões, no caso do câncer colorretal (CRC)². Recentemente, tem-se aumentado a atenção para biópsias líquidas, que são uma ferramenta não invasiva para detectar e enumerar CTCs de amostras de sang....

Protocolo

Todos os protocolos in vivo foram aprovados pelos órgãos de ética animal.

1. Amplificação CTC em Condições de Cultura 3D

1. Para cultivar CTCs em suspensão, os primeiros CTCs de sementes em poços de uma placa de 24 poços de anexo ultra-baixo (ULA) na concentração máxima de 5 células/μL e em 1 mL de m12 médio (ou seja, DMEM-F12 avançado suplementado com 2 mM l-glutamina, penicilina de 100 Unidade/mL e estreptomicina, suplemento N2, 20 ng/mL fator de crescimento epidérmico e fator de crescimento do fibroblasto^{10 ng/mL}).
2. Para permitir a formação da esfera e a expansão celular, incubar a....

Resultados

Ambas as expressões EpCAM e CD26 observadas por IF (Figura 1A painel direito) e FACS ( Figura1B), respectivamente, indicam que a linha CTC é epitelial e exibem uma das marcas do CSC¹⁰. Este traço epitelial pode ser ainda caracterizado pela coloração com anticorpos direcionados contra outros marcadores epiteliais e mesenquimais. Assim, seria possível saber aproximadamente onde está a linha CTC ao longo do eixo epitelial-me.......

Discussão

O protocolo descrito acima foi utilizado inicialmente para caracterização funcional ctc colorretal, mas pode ser usado para outros tipos de câncer, como o câncer de mama e pode ser adaptado para modelos de camundongos.

O verdadeiro fator limitante é o número de CTCs presentes na amostra de sangue e a eficiência da técnica utilizada para isolá-las e expandi-las. Várias técnicas de isolamento CTC foram descritas com base em propriedades específicas de CTC, como o Parsortix, um dispositivo microf.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Solução Accumax	Sigma-Aldrich	A7089
Advanced DMEM/F-12	Gibco	12634028
CellTiter-Glo Ensaio de Viabilidade de Células Luminescentes	Promega	G7570
Corning Matrigel Fator de Crescimento Reduzido (TFG) Matriz de Membrana Embasal	Corning	354230
Costar 24 poços Fundo Plano Transparente Ultra-Baixo Acessório Múltiplo Placas de poço,	Corning	3473
Histiogel Specimen Medium	LabStorage	HG-4000
Human EGF, grau premium	Miltenyi Biotec	130-097-751
Human FGF-2, grau premium	Miltenyi Biotec	130-093-564
L-Glutamina (200 mM)	Gibco	25030081
N-2 Suplemento	Gibco
Penicilina-estreptomicina (5.000 U/mL)	Gibco	15070063

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