يمكن استخدام العمل الشعيرات الدموية الشعاعية التفاضلية من المقايسة ليغاند (DRaCALA) لتحديد البروتينات ملزمة ليغاند الصغيرة من كائن حي باستخدام مكتبة ORFeome.
شهد العقد الماضي تقدما هائلا في فهم جزيئات الإشارات الصغيرة في فسيولوجيا البكتيريا. وعلى وجه الخصوص، تم تحديد البروتينات المستهدفة للعديد من الرسل الثانويين المشتقة من النيوكليوتيدات (NSMs) بشكل منهجي ودراسة في الكائنات الحية النموذجية. ويعزى هذا الإنجاز أساسا إلى تطوير العديد من التقنيات الجديدة بما في ذلك تقنية مركب التقاط والعمل الشعيرات الدموية الشعاعية التفاضلية من المقايسة ليغاند (DRaCALA)، والتي استخدمت لتحديد البروتينات المستهدفة بشكل منهجي من هذه الجزيئات الصغيرة. تصف هذه الورقة استخدام NSMs، وبانتوسين بنتا- و tetraphosphates (p)ppGpp، كمثال ومظاهرة فيديو لتقنية DRaCALA. باستخدام DRaCALA، تم تحديد 9 من أصل 20 البروتينات المستهدفة المعروفة و 12 من (ع) ppGpp في الكائن الحي النموذجي، Escherichia القولونية K-12، مما يدل على قوة هذا المقايسة. من حيث المبدأ ، يمكن استخدام DRaCALA لدراسة الليغندات الصغيرة التي يمكن تصنيفها بالنظائر المشعة أو الأصباغ الفلورية. تتم مناقشة الخطوات الحاسمة والايجابيات والسلبيات من DRaCALA هنا لمزيد من التطبيق لهذه التقنية.
البكتيريا استخدام عدة جزيئات الإشارات الصغيرة للتكيف مع بيئات المتغيرة باستمرار1،2. على سبيل المثال، فإن الحثات الذاتية، N-acylhomoserine lactones وoligopeptides المعدلة، والتوسط في الاتصالات بين الخلايا بين البكتيريا لتنسيق السلوك السكاني، وهي ظاهرة تعرف باسم استشعار النصابالقانوني 2. مجموعة أخرى من جزيئات الإشارات الصغيرة هي NSMs ، بما في ذلك الأدينوسين الدوري الذي تمت دراسته على نطاق واسع أحادي الفوسفات (cAMP) ، ودي أمبير الدوري ، والفوسفات الأحادي الدوري دي جوانوسين (الدوري دي GMP) ، وغوانوزين بنتا – وتترا فوسفات (p)ppGpp1. البكتيريا تنتج هذه NSMs كاستجابة لمجموعة متنوعة من ظروف الإجهاد المختلفة. بمجرد إنتاجها ، ترتبط هذه الجزيئات بالبروتينات المستهدفة وتنظم العديد من المسارات الفسيولوجية والأيضية المختلفة للتعامل مع الضغوط التي تواجهها وتعزيز البقاء البكتيري. لذلك ، فإن تحديد البروتينات المستهدفة هو شرط أساسي لا مفر منه لفك الرموز الوظائف الجزيئية لهذه الجزيئات الصغيرة.
وقد شهد العقد الماضي طفرة في المعرفة بهذه الجزيئات الصغيرة التي تشير إلى ذلك، ويرجع ذلك أساسا إلى العديد من الابتكارات التقنية التي كشفت عن البروتينات المستهدفة لهذه الجزيئات الصغيرة. وتشمل هذه تقنية مركب التقاط3،4،5، والعمل الشعيرات الدموية الشعاعية التفاضلية من المقايسة ليغاند (DRaCALA)6 لمناقشتها في هذه الورقة.
اخترعها فنسنت لي وزملاء العمل في 20116, DRaCALA تنشر قدرة غشاء النيتروسليلوز لعزل التفاضلية الحرة والبروتين ملزمة ligands. جزيئات مثل البروتينات لا يمكن أن تنتشر على غشاء النيتروسليلوز، في حين أن الليغنديات الصغيرة، مثل NSMs، قادرة على. عن طريق خلط NSM(على سبيل المثال، ppGpp) مع البروتين لاختبارها واكتشافها على الغشاء ، يمكن توقع سيناريوهين(الشكل 1):إذا (ع) ppGpp يربط البروتين ، سيتم الاحتفاظ بالعلامات المشعة (p) ppGpp في وسط البقعة بواسطة البروتين ولن ينتشر إلى الخارج ، مما يعطي نقطة صغيرة مكثفة (أي، إشارة مشعة قوية) تحت الفوسفوريماجر. ومع ذلك، إذا (ع)ppGpp لا يرتبط البروتين، وسوف تنتشر بحرية إلى الخارج لإنتاج بقعة كبيرة مع إشارة مشعة خلفية موحدة.
وعلاوة على ذلك، يمكن الكشف عن DRaCALA التفاعل بين جزيء صغير وبروتين غير مبور في lysate خلية كاملة إذا كان البروتين موجود في كمية كافية. هذه البساطة تسمح باستخدام DRaCALA في تحديد أهداف البروتين بسرعة باستخدام مكتبة التعبير ORFeome. في الواقع، البروتينات المستهدفة من cAMP7، دوري دي AMP8، دوري دي GMP9،10، و (ع) ppGpp11،12،13 وقد تم تحديد منهجي باستخدام DRaCALA. تستخدم هذه المقالة الفيديو (p)ppGpp كمثال على إظهار ووصف الخطوات والاعتبارات الهامة في إجراء فحص DRaCALA ناجحة. ملاحظة، ينصح بشدة وصف أكثر شمولا من DRaCALA14 لقراءة بالاشتراك مع هذه المقالة قبل تنفيذ DRaCALA.
الشكل 1: مبدأ DRaCALA. (أ) التخطيطي للدراكالا المقايسة. راجع النص للحصول على التفاصيل. (ب)تحديد وحساب الكسر الملزم. راجع النص للحصول على التفاصيل. باختصار، سيتم تحليل البقع DRaCALA عن طريق رسم دائرتين التي تحد من بقعة كاملة والنقطة المظلمة الداخلية(أي.،وتحتفظ (ع) ppGpp بسبب ربط البروتين اختبارها). إشارة الربط المحددة هي الإشارة المشعة للدائرة الداخلية (S1) بعد طرح إشارة الخلفية غير المحددة (محسوبة ب A1 × ((S2-S1)/(A2-A1)). الكسر الملزم هو إشارة الربط المحددة مقسومة على إجمالي الإشارة المشعة (S2). المختصرات: DRaCALA = العمل الشعيرات الشعرية الشعاعية التفاضلية من المقايسة ليغاند; (ع) ppGpp = جوانوسين بنتا – وتيترافوسفات؛ RT = درجة حرارة الغرفة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
واحدة من الخطوات الحاسمة في أداء فحص DRaCALA هو الحصول على lysates خلية كاملة جيدة. أولا، ينبغي إنتاج البروتينات المختبرة بكميات كبيرة وفي أشكال قابلة للذوبان. ثانيا، يجب أن يكون تحلل الخلايا كاملا، ويجب أن تكون لزوجة التحلل ضئيلة. إدراج lysozyme واستخدام ثلاث دورات من تجميد ذوبان غالبا ما تكون كافي?…
The authors have nothing to disclose.
ويدعم هذا العمل منحة مشروع NNF (NNF19OC0058331) إلى YEZ، وبرنامج أفق الاتحاد الأوروبي للبحث والابتكار لعام 2020 بموجب اتفاقية منحة ماري سكلودوسكا كوري (Nº 801199) إلى MLS.
32P-α-GTP | Perkinelmer | BLU006X250UC | |
96 x pin tool | V&P Scientific | VP 404 | 96 Bolt Replicator, on 9 mm centers, 4.2 mm Bolt Diameter, 24 mm long |
96-well V-bottom microtiter plate | Sterilin | MIC9004 | Sterilin Microplate V Well 611V96 |
Agar | OXOID – Thermo Fisher | LP0011 | Agar no. 1 |
ASKA collection strain | NBRP, SHIGEN, JAPAN | Ref: DNA Research, Volume 12, Issue 5, 2005, Pages 291–299. https://doi.org/10.1093/dnares/dsi012 | |
Benzonase | SIGMA | E1014-25KU | genetically engineered endonuclease from Serratia marcescens |
Bradford Protein Assay Dye | Bio-Rad | 5000006 | Reagent Concentrate |
DMSO | SIGMA | D8418 | ≥99.9% |
DNase 1 | SIGMA | DN25-1G | |
gel filtration10x300 column | GE Healthcare | 28990944 | contains 20% ethanol as preservative |
Glycerol | PanReac AppliChem | 122329.1214 | Glycerol 87% for analysis |
Hypercassette | Amersham | RPN 11647 | 20 x 40 cm |
Imidazole | SIGMA | 56750 | puriss. p.a., ≥ 99.5% (GC) |
IP Storage Phosphor Screen | FUJIFILM | 28956474 | BAS-MS 2040 20x 40 cm |
Isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | SIGMA | I6758 | Isopropyl β-D-thiogalactoside |
Lysogeny Broth (LB) | Invitrogen – Thermo Fisher | 12795027 | Miller's LB Broth Base |
Lysozyme | SIGMA | L4949 | from chicken egg white; BioUltra, lyophilized powder, ≥98% |
MgCl2 (Magnesium chloride) | SIGMA | 208337 | |
MilliQ water | ultrapure water | ||
multichannel pipette | Thermo Scientific | 4661110 | F1 – Clip Tip; 1-10 ul, 8 x channels |
NaCl | VWR Chemicals | 27810 | AnalaR NORMAPUR, ACS, Reag. Ph. Eur. |
Ni-NTA Agarose | Qiagen | 30230 | |
Nitrocellulose Blotting Membrane | Amersham Protran | 10600003 | Premium 0.45 um 300 mm x 4 m |
PBS | OXOID – Thermo Fisher | BR0014G | Phosphate buffered saline (Dulbecco A), Tablets |
PEG3350 (Polyethylene glycol 3350) | SIGMA | 202444 | |
phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | SIGMA | 93482 | Phenylmethanesulfonyl fluoride solution – 0.1 M in ethanol (T) |
Phosphor-imager | GE Healthcare | 28955809 | Typhoon FLA-7000 Phosphor-imager |
Pipette Tips, filtered | Thermo Scientific | 94410040 | ClipTip 12.5 μl nonsterile |
Poly-Prep Chromatography column | Bio-Rad | 7311550 | polypropylene chromatography column |
Protease inhibitor Mini | Pierce | A32955 | Tablets, EDTA-free |
screw cap tube | Thermo Scientific | 3488 | Microcentifuge Tubes, 2.0 ml with screw cap, nonsterile |
SLS 96-deep Well plates | Greiner | 780285 | MASTERBLOCK, 2 ML, PP, V-Bottom, Natural |
spin column | Millipore | UFC500396 | Amicon Ultra -0.5 ml Centrifugal Filters |
Thermomixer | Eppendorf | 5382000015 | Thermomixer C |
TLC plate (PEI-cellulose F TLC plates) | Merck Millipore | 105579 | DC PEI-cellulose F (20 x 20 cm) |
Tris | SIGMA | BP152 | Tris Base for Molecular Biology |
Tween 20 | SIGMA | P1379 | viscous non-ionic detergent |
β-mercaptoethanol | SIGMA | M3148 | 99% (GC/titration) |