זיהוי החלבונים המחייבים של ליגנדים קטנים עם הפעולה הרדיאלית הרדיאלית הדיפרנציאלית של ליגנד אסאי (DRaCALA)
Summary
הפעולה הרדיאלית הרדיאלית של Ligand Assay (DRaCALA) יכולה לשמש לזיהוי חלבונים קטנים מחייבים ליגנד של אורגניזם באמצעות ספריית ORFeome.
Abstract
בעשור האחרון חלה התקדמות עצומה בהבנת מולקולות איתות קטנות בפיזיולוגיה חיידקית. בפרט, חלבוני היעד של מספר שליחים משניים שמקורם בנוקלאוטידים (NSMs) זוהו ונחקרו באופן שיטתי באורגניזמים לדוגמה. הישגים אלה נובעים בעיקר מהתפתחות של מספר טכניקות חדשות, כולל טכניקת תרכובת הלכידה והפעולה הרדיאלית הרדיאלית הדיפרנציאלית של ליגנד אסאי (DRaCALA), אשר שימשו לזיהוי שיטתי של חלבוני יעד של מולקולות קטנות אלה. מאמר זה מתאר את השימוש ב- NSMs, גואנוסין פנטה וטטרפוספטים (p)ppGpp, כדוגמה והדגמת וידאו של טכניקת DRaCALA. באמצעות DRaCALA, 9 מתוך 20 ידוע ו -12 חלבוני יעד חדשים של (p)ppGpp זוהו באורגניזם המודל, Escherichia coli K-12, מדגים את כוחו של מבחנים אלה. באופן עקרוני, DRaCALA יכול לשמש לחקר ליגנדים קטנים שניתן לתייג על ידי איזוטופים רדיואקטיביים או צבעים פלואורסצנטיים. הצעדים הקריטיים, היתרונות והחסרונות של DRaCALA נדונים כאן ליישום נוסף של טכניקה זו.
Introduction
חיידקים משתמשים במספר מולקולות איתות קטנות כדי להסתגל לסביבות המשתנות כל הזמן1,2. לדוגמה, יצרני הרכב, לקטוניםN-acylhomoserine ואוליגופפטידים מותאמים שלהם, לתווך את התקשורת הבין תאית בין חיידקים כדי לתאם את התנהגות האוכלוסייה, תופעה המכונה מניין חישה2. קבוצה נוספת של מולקולות איתות קטנות היא ה- NSMs, כולל המונופוספט אדנוסין מחזורי הנחקר הנחקר (cAMP), די-AMP מחזורי, מונופוספט די-גואנוסין מחזורי (di-GMP מחזורי), וגואנוסין פנטה וטטרה פוספטים (p)ppGpp1. חיידקים מייצרים NSMs אלה כתגובה למגוון של תנאי לחץ שונים. לאחר הייצור, מולקולות אלה נקשרות לחלבוני היעד שלהן ומווסתות מספר מסלולים פיזיולוגיים ומטבוליים שונים כדי להתמודד עם הלחצים שנתקלו ולשפר את הישרדות החיידקים. לכן, זיהוי חלבוני היעד הוא תנאי מוקדם בלתי נמנע לפענוח הפונקציות המולקולריות של מולקולות קטנות אלה.
העשור האחרון היה עד לפריחה של ידע על מולקולות איתות קטנות אלה, בעיקר בשל מספר חידושים טכניים שחשפו את חלבוני היעד של מולקולות קטנות אלה. אלה כוללים את טכניקת תרכובת לכידה3,4,5, ואת הפעולה נימי רדיאלי דיפרנציאלי של ליגנד אסאי (DRaCALA)6 כדי לדון במאמר זה.
הומצא על ידי וינסנט לי ושותפיו לעבודה בשנת 20116,DRaCALA פורס את היכולת של קרום ניטרוצלולוז לבודד דיפרנציאלי ללא ליגנדים הקשורים לחלבון. מולקולות כגון חלבונים אינן יכולות לפזר על קרום ניטרוצלולוז, בעוד ליגנדים קטנים, כגון NSMs, מסוגלים. על ידי ערבוב ה- NSM (למשל,ppGpp) עם החלבון שייבדק וזיהוים על הממברנה, ניתן לצפות לשני תרחישים (איור 1):אם (p)ppGpp נקשר לחלבון, ה- radiolabeled (p)ppGpp יישמר במרכז המקום על ידי החלבון ולא יפזר כלפי חוץ, וייתן נקודה קטנה ואינטנסיבית (כלומר. אות רדיואקטיבי חזק) תחת זרחן. עם זאת, אם (p)pppp אינו נקשר לחלבון, הוא יפזר בחופשיות כלפי חוץ כדי לייצר נקודה גדולה עם אות רדיואקטיבי ברקע אחיד.
יתר על כן, DRaCALA יכול לזהות את האינטראקציה בין מולקולה קטנה וחלבון לא מנוצל בתא שלם ליסייט אם החלבון קיים בכמות מספקת. פשטות זו מאפשרת שימוש ב- DRaCALA בזיהוי מהיר של מטרות חלבון באמצעות ספריית ביטוי ORFeome. ואכן, חלבוני היעד של cAMP7, די-AMPמחזורי 8, די-GMP מחזורי9,10, ו (p)ppGpp11,12,13 זוהו באופן שיטתי באמצעות DRaCALA. מאמר וידאו זה משתמש (p)ppGpp כדוגמה כדי להדגים ולתאר את השלבים והשיקולים הקריטיים בביצוע הקרנת DRaCALA מוצלחת. הערה, תיאור יסודי יותר של DRaCALA14 מומלץ מאוד לקרוא בשילוב עם מאמר זה לפני ביצוע DRaCALA.
איור 1: העיקרון של DRaCALA. (א)סכמטי של תפילת DRaCALA. עיין בטקסט לקבלת פרטים. (B)כימות וחישוב של שבר האיגוד. עיין בטקסט לקבלת פרטים. בקצרה, כתמי DRaCALA ינותחו על ידי ציור שני עיגולים שמגבילים את כל הנקודה ואת הנקודה הכהה הפנימית (כלומר,נשמר (p)pppp עקב כריכת החלבון שנבדק). אות האיגוד הספציפי הוא האות הרדיואקטיבי של המעגל הפנימי (S1) לאחר חיסור אות הרקע הלא ספציפי (מחושב על-ידי A1 × ((S2-S1)/(A2-A1))). שבר האיגוד הוא אות האיגוד הספציפי חלקי האות הרדיואקטיבי הכולל (S2). קיצורים: DRaCALA = פעולה נימית רדיאלית דיפרנציאלית של ליגנד אסאי; (p)ppGpp = גואנוסין פנטה וטטרפוספטים; RT = טמפרטורת החדר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Protocol
Representative Results
Discussion
אחד השלבים הקריטיים בביצוע הקרנת DRaCALA הוא להשיג lysates תא שלם טוב. ראשית, החלבונים שנבדקו צריכים להיות מיוצרים בכמויות גדולות ובצורות מסיסות. שנית, התמותה של התאים צריכה להיות שלמה, ואת הצמיגות של lysate חייב להיות מינימלי. הכללת lysozyme ושימוש בשלושה מחזורים של הפשרת הקפאה הם לעתים קרובות מספיק כד…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
העבודה נתמכת על ידי מענק פרויקט NNF (NNF19OC0058331) ל- YEZ, ותוכנית המחקר והחדשנות Horizon 2020 של האיחוד האירופי במסגרת הסכם המענקים מארי Skłodowska-Curie (Nº 801199) ל- MLS.
Materials
| 32P-α-GTP | Perkinelmer | BLU006X250UC | |
| 96 x pin tool | V&P Scientific | VP 404 | 96 Bolt Replicator, on 9 mm centers, 4.2 mm Bolt Diameter, 24 mm long |
| 96-well V-bottom microtiter plate | Sterilin | MIC9004 | Sterilin Microplate V Well 611V96 |
| Agar | OXOID – Thermo Fisher | LP0011 | Agar no. 1 |
| ASKA collection strain | NBRP, SHIGEN, JAPAN | Ref: DNA Research, Volume 12, Issue 5, 2005, Pages 291–299. https://doi.org/10.1093/dnares/dsi012 | |
| Benzonase | SIGMA | E1014-25KU | genetically engineered endonuclease from Serratia marcescens |
| Bradford Protein Assay Dye | Bio-Rad | 5000006 | Reagent Concentrate |
| DMSO | SIGMA | D8418 | ≥99.9% |
| DNase 1 | SIGMA | DN25-1G | |
| gel filtration10x300 column | GE Healthcare | 28990944 | contains 20% ethanol as preservative |
| Glycerol | PanReac AppliChem | 122329.1214 | Glycerol 87% for analysis |
| Hypercassette | Amersham | RPN 11647 | 20 x 40 cm |
| Imidazole | SIGMA | 56750 | puriss. p.a., ≥ 99.5% (GC) |
| IP Storage Phosphor Screen | FUJIFILM | 28956474 | BAS-MS 2040 20x 40 cm |
| Isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | SIGMA | I6758 | Isopropyl β-D-thiogalactoside |
| Lysogeny Broth (LB) | Invitrogen – Thermo Fisher | 12795027 | Miller's LB Broth Base |
| Lysozyme | SIGMA | L4949 | from chicken egg white; BioUltra, lyophilized powder, ≥98% |
| MgCl2 (Magnesium chloride) | SIGMA | 208337 | |
| MilliQ water | ultrapure water | ||
| multichannel pipette | Thermo Scientific | 4661110 | F1 – Clip Tip; 1-10 ul, 8 x channels |
| NaCl | VWR Chemicals | 27810 | AnalaR NORMAPUR, ACS, Reag. Ph. Eur. |
| Ni-NTA Agarose | Qiagen | 30230 | |
| Nitrocellulose Blotting Membrane | Amersham Protran | 10600003 | Premium 0.45 um 300 mm x 4 m |
| PBS | OXOID – Thermo Fisher | BR0014G | Phosphate buffered saline (Dulbecco A), Tablets |
| PEG3350 (Polyethylene glycol 3350) | SIGMA | 202444 | |
| phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | SIGMA | 93482 | Phenylmethanesulfonyl fluoride solution – 0.1 M in ethanol (T) |
| Phosphor-imager | GE Healthcare | 28955809 | Typhoon FLA-7000 Phosphor-imager |
| Pipette Tips, filtered | Thermo Scientific | 94410040 | ClipTip 12.5 μl nonsterile |
| Poly-Prep Chromatography column | Bio-Rad | 7311550 | polypropylene chromatography column |
| Protease inhibitor Mini | Pierce | A32955 | Tablets, EDTA-free |
| screw cap tube | Thermo Scientific | 3488 | Microcentifuge Tubes, 2.0 ml with screw cap, nonsterile |
| SLS 96-deep Well plates | Greiner | 780285 | MASTERBLOCK, 2 ML, PP, V-Bottom, Natural |
| spin column | Millipore | UFC500396 | Amicon Ultra -0.5 ml Centrifugal Filters |
| Thermomixer | Eppendorf | 5382000015 | Thermomixer C |
| TLC plate (PEI-cellulose F TLC plates) | Merck Millipore | 105579 | DC PEI-cellulose F (20 x 20 cm) |
| Tris | SIGMA | BP152 | Tris Base for Molecular Biology |
| Tween 20 | SIGMA | P1379 | viscous non-ionic detergent |
| β-mercaptoethanol | SIGMA | M3148 | 99% (GC/titration) |
Referências
- Kalia, D., et al. Nucleotide, c-di-GMP, c-di-AMP, cGMP, cAMP, (p)ppGpp signaling in bacteria and implications in pathogenesis. Chemical Society Reviews. 42 (1), 305-341 (2013).
- Camilli, A., Bassler, B. L. Bacterial small-molecule signaling pathways. Science. 311 (5764), 1113-1116 (2006).
- Luo, Y., et al. The cAMP capture compound mass spectrometry as a novel tool for targeting cAMP-binding proteins: from protein kinase A to potassium/sodium hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channels. Molecular & Cellular Proteomics. 8 (12), 2843-2856 (2009).
- Nesper, J., Reinders, A., Glatter, T., Schmidt, A., Jenal, U. A novel capture compound for the identification and analysis of cyclic di-GMP binding proteins. Journal of Proteomics. 75 (15), 4874-4878 (2012).
- Laventie, B. J., et al. Capture compound mass spectrometry–a powerful tool to identify novel c-di-GMP effector proteins. Journal of Visual Experiments. (97), e51404 (2015).
- Roelofs, K. G., Wang, J., Sintim, H. O., Lee, V. T. Differential radial capillary action of ligand assay for high-throughput detection of protein-metabolite interactions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (37), 15528-15533 (2011).
- Zhang, Y., et al. Evolutionary adaptation of the essential tRNA methyltransferase TrmD to the signaling molecule 3 ‘,5 ‘-cAMP in bacteria. Journal of Biological Chemistry. 292 (1), 313-327 (2017).
- Corrigan, R. M., et al. Systematic identification of conserved bacterial c-di-AMP receptor proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (22), 9084-9089 (2013).
- Roelofs, K. G., et al. Systematic identification of cyclic-di-GMP binding proteins in Vibrio cholerae reveals a novel class of cyclic-di-GMP-binding ATPases associated with type II secretion systems. PLoS Pathogen. 11 (10), 1005232 (2015).
- Fang, X., et al. GIL, a new c-di-GMP-binding protein domain involved in regulation of cellulose synthesis in enterobacteria. Molecular Microbiology. 93 (3), 439-452 (2014).
- Corrigan, R. M., Bellows, L. E., Wood, A., Grundling, A. ppGpp negatively impacts ribosome assembly affecting growth and antimicrobial tolerance in Gram-positive bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 1710-1719 (2016).
- Zhang, Y., Zbornikova, E., Rejman, D., Gerdes, K. Novel (p)ppGpp binding and metabolizing proteins of Escherichia coli. Mbio. 9 (2), 02188 (2018).
- Yang, J., et al. The nucleotide pGpp acts as a third alarmone in Bacillus, with functions distinct from those of (p) ppGpp. Nature Communications. 11 (1), 5388 (2020).
- Orr, M. W., Lee, V. T. Differential radial capillary action of ligand assay (DRaCALA) for high-throughput detection of protein-metabolite interactions in bacteria. Methods in Molecular Biology. 1535, 25-41 (2017).
- Kitagawa, M., et al. Complete set of ORF clones of Escherichia coli ASKA library (A complete Set of E. coli K-12 ORF archive): Unique resources for biological research. DNA Research. 12 (5), 291-299 (2005).
- Hochstadt-Ozer, J., Cashel, M. The regulation of purine utilization in bacteria. V. Inhibition of purine phosphoribosyltransferase activities and purine uptake in isolated membrane vesicles by guanosine tetraphosphate. Journal of Biological Chemistry. 247 (21), 7067-7072 (1972).
- Zhang, Y. E., et al. p)ppGpp regulates a bacterial nucleosidase by an allosteric two-domain switch. Molecular Cell. 74 (6), 1239-1249 (2019).
- Wang, B., et al. Affinity-based capture and identification of protein effectors of the growth regulator ppGpp. Nature Chemical Biology. 15 (2), 141-150 (2019).
