Este artigo descreve um protocolo detalhado para o uso de sondas de tensão baseadas em DNA para obter imagens das forças receptoras aplicadas por células imunes. Essa abordagem pode mapear forças receptoras >4.7pN em tempo real e pode integrar forças ao longo do tempo.
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Artigo de método
Sondas de Tensão de DNA para Mapear as Forças Transitórias do Receptor de Piconewton por Células Imunes
Neste artigo
Resumo
Resumo
As forças mecânicas transmitidas na junção entre duas células vizinhas e na junção entre as células e a matriz extracelular são críticas para a regulação de muitos processos que vão desde o desenvolvimento até a imunologia. Portanto, desenvolver ferramentas para estudar essas forças em escala molecular é fundamental. Nosso grupo desenvolveu um conjunto de sensores de tensão molecular para quantificar e visualizar as forças geradas pelas células e transmitidas a ligantes específicos. A classe mais sensível de sensores de tensão molecular é composta por grampos de alça de haste de ácido nucleico. Esses sensores usam pares fluoróforo-quencher para relatar a extensão mecânica e o desdobramento de pinos de cabelo de DNA sob força. Um desafio com os sensores de tensão hairpin de DNA é que eles são reversíveis com redobramento rápido do hairpin após o término da tensão e, portanto, as forças transitórias são difíceis de registrar. Neste artigo, descrevemos os protocolos de preparação de sensores de tensão de DNA que podem ser "travados" e impedidos de redobrar para permitir o "armazenamento" de informações mecânicas. Isso permite o registro de forças de piconewton altamente transitórias, que podem ser posteriormente "apagadas" pela adição de ácidos nucleicos complementares que removem a fechadura. Essa capacidade de alternar entre o mapeamento de tensão em tempo real e o armazenamento de informações mecânicas revela forças fracas, de curta duração e menos abundantes, que são comumente empregadas pelas células T como parte de suas funções imunológicas.
Introdução
As células imunes defendem-se contra patógenos e células cancerígenas rastejando e varrendo continuamente as superfícies das células-alvo em busca de antígenos, fixando sua superfície 1,2. O reconhecimento do antígeno é iniciado após a ligação entre o receptor de células T (TCR) e o complexo MHC (pMHC) do complexo peptídeo-principal de histocompatibilidade expresso na superfície das células-alvo. Como o reconhecimento do TCR-pMHC ocorre na junção entre duas células móveis, há muito se suspeita que ele experimente forças mecânicas. Além disso, isso levou ao modelo mecanosensor de ativação do TCR, que sugere que....
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Protocolo
Os camundongos transgênicos OT-1 estão alojados na Divisão de Recursos Animais da Universidade de Emory. Todos os experimentos foram aprovados e realizados sob o protocolo da Comissão Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC).
1. Preparação de oligonucleotídeos
- Dissolver o DNA da fita ligante em água (resistividade de 18,2 MΩ, utilizada durante todo o protocolo). Vórtice e gire a solução com uma centrífuga de mesa. Ajuste o volume de água de tal forma que a concentração final seja de 1 mM. Validar a concentração usando um espectrofotômetro de nanogotas para medir a absorbância a 260 nm e determinar a concentração final co....
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Resultados
Aqui mostramos imagens representativas de controle de qualidade de superfície (Figura 4). Uma superfície de alta qualidade deve ter um fundo limpo no canal RICM (Figura 4B) e intensidade de fluorescência uniforme no canal Cy3B (Figura 4C). Com o mesmo equipamento de imagem e condições idênticas de aquisição de imagens de fluorescência, a intensidade de fluorescência de fundo deve ser consistente e reprodutível sempre ao realizar exp.......
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Discussão
Com os procedimentos detalhados fornecidos aqui, pode-se preparar substratos de sonda de tensão de DNA hairpin para mapear e quantificar a tensão do receptor produzida pelas células imunes. Quando as células são plaqueadas no substrato da sonda de tensão do pino de DNA, elas pousam, se ligam e se espalham à medida que os receptores detectam os ligantes química e mecanicamente, o último dos quais é detectado por nossas sondas. No entanto, em alguns casos, as células podem não se espalhar (Figura 7A
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Divulgações
Os autores declaram a inexistência de conflitos de interesse.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pelos NIH Grants R01GM131099, NIH R01GM124472 e NSF CAREER 1350829. Agradecemos ao NIH Tetramer Facility pelos ligantes pMHC. Este estudo foi apoiado, em parte, pelo Emory Comprehensive Glycomics Core.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| ácido 3-hidroxipicolínico (3-HPA) | Sigma | 56197 | maldi-TOF-MS matrix |
| mPEG-SC | Biochempeg | MF001023-2K preparação de | superfície |
| (3-Aminopropil) trietoxissilano | Acros | AC430941000 | |
| preparação de superfície 10x Tampão de lise de glóbulos vermelhos | Biolegend | 00-4333-57 | tampão |
| 8,8 nm nanopartículas de ouro, ácido tânico | Nanocomposix | personalizado pedido | preparação de superfície |
| Atto647N NHS éster | Sigma | 18373-1MG-F | fluoróforo, oligo prep |
| Attofluor Cell Chamber, para microscopia | Thermo Fisher Scientific | A7816 | imaging |
| BD Seringas apenas com Luer-Lok | BD bioscience | 309657 | cells |
| biotinilated anti-mouse CD3e | ebioscience | 13-0031-82 | anticorpo/ligante |
| Ovalbumina pMHC biotinilada (SIINFEKL) | NIH Tetramer Core Facility na Emory University | Anticorpo | /ligante |
| albumina sérica bovina | Sigma | 735078001 | bloqueia interações não específicas |
| Filtros celulares | Biologix | 15-1100 | células |
| Coverslip Mini-Rack, teflon | Thermo Fisher Scientific | C14784 | preparação de superfície |
| Cy3B NHS éster | GE Healthcare | PA63101 | fluoróforo, oligo preparação |
| Solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (DPBS) | Corning | 21-031-CM | tampão |
| etanol | Sigma | 459836 | preparação de superfície |
| Hank' s sais balanceados (HBSS) | Sigma | H8264 | tampão |
| peróxido de hidrogênio | Sigma | H1009 | preparação de superfície |
| LA-PEG-SC | Biochempeg | HE039023-3.4K | preparação de superfície |
| Midi MACS (LS) kit de inicialização | Miltenyi Biotec | 130-042-301 | células |
| de camundongo CD8+ kit de isolamento de células T | Miltenyi Biotec | 130-104-075 | células |
| Dispositivos centrífugos Nanosep MF | Pall laboratório | ODM02C35 | preparação de oligo |
| No. 2 lamínulas de vidro redondas | VWR | 48382-085 | preparação de superfície |
| NTA-SAM | Dojindo Molecular Technologies | N475-10 | superfície |
| P2 gel | Bio-rad | 1504118 | oligo preparação |
| ácido sufúrico | EMD Millipore Corporation | SX1244-6 | preparação de superfície |
| Acetato de Sulfo-NHS | Thermo Fisher Scientific | 26777 | preparação de superfície |
| Equipamento | |||
| Agilent AdvanceBio Oligonucleotídeo C18 coluna, 4,6 x 150 mm, 2,7 μ m | 653950-702 | preparação de oligonucleotídeos | |
| Barnstead Sistema de purificação de água nanopura | Água Thermo Fisher | ||
| CFI Apo 100× NA 1.49 objetiva | Nikon | Microscopia | |
| Cy5 cubo | CHROMA | Microscopia | |
| evoluir dispositivo acoplado de carga multiplicadora de elétrons (EMCCD) | Microscopia fotométrica | ||
| Cromatografia líquida de alta eficiência | Agilent 1100 | preparação de oligonucleotídeos | |
| Fonte de epifluorescência Intensilight | Nikon | Microscopia | |
| Espectrômetro de massa de tempo de voo de dessorção/ionização a laser assistido por matriz (MALDI-TOF-MS)Preparação | de oligonucleotídeos | Voyager STR | |
| Espectrofotômetro UV-Vis Nanodrop 2000 Preparação | de oligonucleotídeos | Thermo Fisher | |
| Microscópio invertido Nikon Eclipse Ti | Microscopia | ||
| Perfect Focus System | Nikon Nikon | Microscopia | |
| NIS Elements software | Nikon | Microscopy | |
| quad band TIRF 405/488/561/647 cubo | CHROMA | Microscopia | |
| RICM cubo | CHROMA | Microscopia | |
| Lançador TIRF com 488 nm (50 mW), 561 nm (50 mW) e 640 nm | Microscopia | Coerente | |
| TRITC cubo | CHROMA | Microscopia | |
| < nome > oligo forte< / forte > | < forte > modificação de 5 '/ modificação de 3 '< / forte > | < forte > sequência (5 'a 3') < / forte > | < forte > Uso < / forte > |
| 15mer fio de travamento de amina | < forte > 5 'modificação: < / forte> sem modificação < BR / > < forte > 3 ': /3AmMO/ | AAA AAA CAT TTA TAC CCT ACC TA | bloqueando sinal de tensão em tempo real |
| 15mer Atto647N fio de travamento | 5' modificação: Atto647N 3' modificação: /3AmMO/ | AAA AAA CAT TTA TAC CCT ACC | bloqueio de sinal de tensão em tempo real |
| 15mer fio | de travamento não fluorescente5' modificação: sem modificação 3' modificação: sem modificação | UM AAA AAC ATT TAT AC | bloqueio de sinal de tensão em tempo real para análise quantitativa |
| 4,7 pN fio de grampo de cabelo | 5' modificação: sem modificação 3' modificação: sem modificação | GTGAAATACCGCACAGATGCGT TTGTATAAATGTTTTTTTCATTTAT ACTTTAAGAGCGCCACGTAGCC CAGC | hairpin probe |
| fio de ligante de amina | 5' modificação: /5AmMC6/ 3' modificação: /3Bio/ | CGCATCTGTGCG GTA TTT CAC TTT | ponta de prova hairpin |
| BHQ2 fio | de ancoragem5' modificação: /5ThiolMC6-D/ 3' modificação: /3BHQ_2/ | TTTGCTGGGCTACGTGGCGCTCTT | sonda de grampo de cabelo |
| Cy3B ligante strand | 5' modificação: Cy3B 3' modificação: /3Bio/ | CGCATCTGTGCG GTA TTT CAC TTT | sonda de grampo |
| de cabelo destravando a < | forte>5' modificação: sem modificação 3' modificação: nenhuma modificação | TAG GTA GGG TAT AAA TGT TTT TTT C | desbloqueando sinal de tensão acumulada |
Referências
- Dustin, M. L. T-cell activation through immunological synapses and kinapses. Immunological Reviews. 221 (1), 77-89 (2008).
- Spillane, K. M., Tolar, P. B cell antigen extraction is regulated by physical properties of antigen-presenting cells.
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Reimpressões e permissões
