Gedeeltelijke hepatectomie bij volwassen zebravissen
Summary
Dit protocol beschrijft de procedure voor het verwijderen van de ventrale kwab van de lever bij volwassen zebravissen om de studie van leverregeneratie mogelijk te maken.
Abstract
Leverfalen is een van de belangrijkste doodsoorzaken wereldwijd, en de sterfte aan chronische leverziekte neemt sterk toe in de Verenigde Staten. Gezonde levers zijn in staat om te regenereren van toxische schade, maar bij gevorderde leverziekte is het natuurlijke vermogen van de lever om te regenereren aangetast. Zebravissen zijn ontstaan als een krachtig experimenteel systeem voor het bestuderen van regeneratie. Ze zijn een ideaal model voor het bestuderen van leverregeneratie van gedeeltelijke hepatectomie, een procedure met directe klinische relevantie waarbij een deel van de lever chirurgisch wordt verwijderd, waardoor de rest intact blijft. Er is geen standaardprotocol voor gedeeltelijke hepatectomie; eerdere studies met dit model hebben iets verschillende protocollen gebruikt en ongelijksoortige resultaten gerapporteerd. Hier beschreven is een efficiënt, reproduceerbaar protocol voor het uitvoeren van een gedeeltelijke hepatectomie bij volwassen zebravissen. We gebruiken deze techniek om aan te tonen dat zebravissen in staat zijn tot epimorfe regeneratie van de gereseceerde kwab. Dit protocol kan worden gebruikt om de mechanismen die nodig zijn voor leverregeneratie bij zebravissen verder te ondervragen.
Introduction
Onder de vaste organen bij mensen is de lever het enige orgaan dat in staat is tot regeneratie1. Dit is van cruciaal belang, omdat de lever een essentieel orgaan is, verantwoordelijk voor belangrijke metabolische functies, energieopslag, bloedontgifting, afscheiding van plasma-eiwitten en galproductie2. Hepatocyten die verloren gaan als gevolg van toxische of inflammatoire schade worden voornamelijk vervangen door deling van de resterende hepatocyten1. Een klassiek experimenteel model voor het bestuderen van leverregeneratie is gedeeltelijke hepatectomie, waarbij individuele kwabben van de lever worden verwijderd, waardoor de resterende kwabben intact blijven3. Deze procedure werd aanvankelijk ontwikkeld bij ratten, waarbij ongeveer tweederde van de levermassa wordt verwijderd. Na gedeeltelijke hepatectomie bij zoogdieren vindt compenserende regeneratie plaats in de resterende kwabben totdat de lever zijn oorspronkelijke massa herstelt. Met name de zoogdierlever vervangt de ontbrekende kwabben niet.
Zebravis (Danio rerio) vertegenwoordigt een tracteerbaar model voor het bestuderen van volwassen orgaanregeneratie4. De zebravislever, hoewel structureel verschillend van de zoogdierlever, bestaat uit dezelfde celtypen en vervult dezelfde functie als bij zoogdieren2. Het bestaat uit drie lobben, met twee dorsale lobben en een enkele ventrale kwab die langs de darm zijn afgeplat. Gedeeltelijke hepatectomie is eerder uitgevoerd bij zebravissen, met tegenstrijdige rekeningen over de precieze wijze van regeneratie. Meestal wordt een derde gedeeltelijke hepatectomie uitgevoerd door verwijdering van de hele ventrale kwab. Eerste rapporten gaven aan dat na verwijdering van de ventrale kwab, het volledig werd geregenereerd binnen een week5,6,7, wat suggereert dat in tegenstelling tot de zoogdierlever, de zebravislever in staat is tot epimorfe regeneratie. Latere studies toonden aan dat verwijdering van de ventrale kwab resulteerde in compenserende regeneratie in de dorsale kwabben, in plaats van de regeneratie van de ontbrekende ventrale kwab, en uiteindelijk het herstel van levermassa binnen een week8,9. Transcriptomische profilering van de dorsale kwabben na resectie van de ventrale kwab bracht significante veranderingen aan het licht die verband houden met compenserende regeneratie10. Gezien het feit dat de wijze van leverregeneratie kan variëren met de omvang van de verwonding8, speculeerden we dat de verschillen in resultaten te wijten kunnen zijn aan technische variatie in het partiële hepatectomieprotocol tussen onderzoeksgroepen.
Dit protocol beschrijft een procedure voor het uitvoeren van een derde gedeeltelijke hepatectomie op volwassen zebravissen door het verwijderen van de ventrale kwab. Deze techniek zal waardevol zijn voor het beoordelen van mechanismen van leverregeneratie.
Protocol
Representative Results
Discussion
De anatomische verschillen tussen zebravissen en zoogdiermodellen voor leverregeneratie vormen unieke uitdagingen voor leverresectie. De lever bij zebravissen bevindt zich in de nabijheid van het hart en de darm; onbedoeld beschadigen van beide organen leidt tot verhoogde mortaliteit. De zebravislever is niet ingekapseld, waardoor het moeilijker is om van de darm te scheiden. De lever ontvangt voedingsrijk bloed uit de darm via poortaders. Bij zoogdieren komen aders die de darm verlaten samen op een primaire poortader di…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
I.M.O. wordt ondersteund door de NIAAA (F32AA027135). W.G. wordt ondersteund door R01DK090311, R01DK105198, R24OD017870 en het Claudia Adams Barr Program for Excellence in Cancer Research. W.G. is een Pew Scholar in Biomedical Sciences.
Materials
| 16% Paraformaldehyde Aqueous Solution, EM Grade | Electron Microscopy Sciences | 15700 | |
| 50 mL Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile | Corning | 352098 | |
| AS 82/220.R2 PLUS Analytical Balance | Bay State Scale & Systems, INC. | WL-104-1051 | |
| Dumont #55 Forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| EMS Kuehne Coverglass/Specimen Forceps | Electron Microscopy Sciences | 72997-07 | |
| Epifluorescence microscope | Zeiss | Discovery.V8 | |
| Mastertop Cellulose Cleaning Scrub Sponge | Amazon | B07CBSM53Z | |
| PBS10X Liquid Conc 4L | EMD Millipore | 6505-4L | |
| Super Fine Micro Scissors, 3 1/4" straight | Biomedical Research Instruments | 11-1020 | |
| Tricaine methanesulfonate | Syndel | TRIC-M-GR-0010 | |
| Tween 20, Fisher BioReagents | Fischer Scientific | BP337-500 |
Referências
- Michalopoulos, G. K. Principles of liver regeneration and growth homeostasis. Comprehensive Physiology. 3, 485-513 (2013).
- Wang, S., Miller, S. R., Ober, E. A., Sadler, K. C. Making it new again: insight into liver development, regeneration, and disease from zebrafish research. Current Topics in Developmental Biology. 124, (2017).
- Michalopoulos, G. K., Bhushan, B. Liver regeneration: biological and pathological mechanisms and implications. Nature Reviews Gastroenterology and Hepatology. , (2020).
- Gemberling, M., Bailey, T. J., Hyde, D. R., Poss, K. D. The zebrafish as a model for complex tissue regeneration. Trends in Genetics. 29, 611-620 (2013).
- Sadler, K. C., Krahn, K. N., Gaur, N. A., Ukomadu, C. Liver growth in the embryo and during liver regeneration in zebrafish requires the cell cycle regulator uhrf1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 1570-1575 (2007).
- Goessling, W., et al. APC mutant zebrafish uncover a changing temporal requirement for wnt signaling in liver development. Biologia do Desenvolvimento. 320, 161-174 (2008).
- Dovey, M., et al. Topoisomerase II is required for embryonic development and liver regeneration in zebrafish. Molecular and Cellular Biology. 29, 3746-3753 (2009).
- Kan, N. G., Junghans, D., Belmonte, J. C. I. Compensatory growth mechanisms regulated by BMP and FGF signaling mediate liver regeneration in zebrafish after partial hepatectomy. The FASEB Journal. 23, 3516-3525 (2009).
- Zhu, Z., Chen, J., Xiong, J. W., Peng, J. Haploinsufficiency of Def activates p53-dependent TGFβ signalling and causes scar formation after partial hepatectomy. PLoS One. 9, (2014).
- Feng, G., Long, Y., Peng, J., Li, Q., Cui, Z. Transcriptomic characterization of the dorsal lobes after hepatectomy of the ventral lobe in zebrafish. BMC Genomics. 16, 979 (2015).
- Michalopoulos, G. K. Liver regeneration. Journal of Cellular Physiology. 213, 286-300 (2007).
- Grisham, J. W. Organizational principles of the liver. The Liver: Biology and Pathobiology: Fifth Edition. , 1-15 (2009).
