بروتوكول استخراج الحمض النووي للبعوض القائم على الخرز المغناطيسي لتسلسل الجيل التالي
Summary
الموصوف هنا هو بروتوكول استخراج الحمض النووي باستخدام الخرز المغناطيسي لإنتاج استخراج الحمض النووي عالية الجودة من البعوض. هذه الاستخراجات مناسبة لنهج تسلسل الجيل التالي من المصب.
Abstract
اقترح بروتوكول استخراج الحمض النووي الذي نشر مؤخرا باستخدام الخرز المغناطيسي وأداة استخراج الحمض النووي الآلي أنه من الممكن استخراج الحمض النووي عالي الجودة والكمية من بعوضة فردية محفوظة جيدا كافية لتسلسل الجينوم الكامل في المصب. ومع ذلك، يمكن أن يكون الاعتماد على أداة استخراج الحمض النووي الآلية باهظة الثمن مانعة بالنسبة للعديد من المختبرات. هنا ، توفر الدراسة بروتوكول استخراج الحمض النووي القائم على حبة مغناطيسية صديقة للميزانية ، وهو مناسب للنسب المنخفضة إلى المتوسطة. تم اختبار البروتوكول الموصوف هنا بنجاح باستخدام عينات البعوض Aedes aegypti الفردية. سيؤدي انخفاض التكاليف المرتبطة باستخراج الحمض النووي عالي الجودة إلى زيادة تطبيق تسلسل الإنتاجية العالية على المختبرات والدراسات المحدودة الموارد.
Introduction
وقد سمح التطور الأخير لبروتوكول استخراج الحمض النووي المحسن1 بالعديد من الدراسات عالية التأثير في المصب التي تنطوي على تسلسل الجينوم الكامل2و3و4و5و6. يوفر بروتوكول استخراج الحمض النووي القائم على الخرز المغناطيسي هذا غلة الحمض النووي الموثوقة من عينات البعوض الفردية ، مما يقلل بدوره من التكلفة والوقت المرتبط بالحصول على عدد كاف من العينات من مجموعات الحقول.
وترتبط التطورات الأخيرة في علم الجينوم السكاني والمناظر الطبيعية ارتباطا مباشرا بانخفاض تكاليف تسلسل الجينوم بأكمله. على الرغم من أن بروتوكول استخراج الحمض النووي السابق1 يزيد من الكفاءة المرتبطة بالتسلسل الإنتاجي العالي ، إلا أن المختبرات / الدراسات الأصغر بدون الأموال قد تختار عدم استخدام هذه المناظر الطبيعية القوية الجديدة وأدوات الجينوم السكاني بسبب تكاليف تنفيذ البروتوكول (على سبيل المثال ، تكاليف الأدوات المتخصصة).
هنا، يتم تقديم بروتوكول استخراج الحمض النووي المعدلة التي تستخدم خطوة استخراج حبة مغناطيسية مماثلة نيمان وآخرون1 للحصول على الحمض النووي عالية النقاء ولكن لا تعتمد على أدوات عالية التكلفة لتحلل الأنسجة واستخراج الحمض النووي. هذا البروتوكول مناسب للتجارب التي تتطلب >10 نانوغرام من الحمض النووي عالي الجودة.
Protocol
Representative Results
Discussion
يمكن تكييف البروتوكول الموصوف هنا لأنواع الحشرات الأخرى. وقد تم اختبار النسخة الأصلية من البروتوكول الذي تم تقديمه في نيمان وآخرون1 على أنواع متعددة، بما في ذلك Aedes aegypti، Ae. busckii، Ae. taeniorhynchus، Anopheles arabiensis، An. coluzzii، An. coustani, An. دارلينجي, An. funestus, An. غامبي, An. quadriannulatus, An. rufipes, Culex pipiens, C…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نعترف بدعم التمويل من مركز جنوب غرب المحيط الهادئ الإقليمي للتميز للأمراض المنقولة بالنواقل الممول من المراكز الأمريكية لمكافحة الأمراض والوقاية منها (الاتفاقية التعاونية 1U01CK000516)، منحة CDC NU50CK000420-04-04، المعهد الوطني للأغذية والزراعة التابع لوزارة الزراعة الأميركية (مشروع هاتش 1025565)، وزمالة مختبر الحشرات الطبية في فلوريدا UF/IFAS إلى Tse-Yu Chen، ومنحة المرحلة الثانية من المرحلة الثانية من اتفاقية الأمن القومي CAMTech CAMTech (AWD05009_MOD0030)، ووزارة الصحة في فلوريدا (CONTRACT CODQJ). النتائج والاستنتاجات الواردة في هذه المقالة هي تلك التي المؤلف (ق) ولا تمثل بالضرورة وجهات نظر دائرة الأسماك والحياة البرية في الولايات المتحدة.
Materials
| AE Buffer | Qiagen | 19077 | Elution buffer |
| AL Buffer | Qiagen | 19075 | Lysis buffer |
| AW1 Buffer | Qiagen | 19081 | Washing buffer 1 |
| AW2 Buffer | Qiagen | 19072 | Washing buffer 2 |
| MagAttract Suspension G | Qiagen | 1026901 | magnetic bead |
| Magnetic bead separator | Epigentek | Q10002-1 | |
| Nanodrop | ThermoFisher | ND-2000 | microvolume spectrophotometer |
| PK Buffer | ThermoFisher | 4489111 | Proteinase K buffer |
| Proteinase K | ThermoFisher | A25561 | |
| Qubit | Invitrogen | Q33238 | fluorometer |
Referências
- Nieman, C. C., Yamasaki, Y., Collier, T. C., Lee, Y. A DNA extraction protocol for improved DNA yield from individual mosquitoes. F1000Research. 4, 1314 (2015).
- Lee, Y., et al. Genome-wide divergence among invasive populations of Aedes aegypti in California. BMC Genomics. 20 (1), 204 (2019).
- Schmidt, H., et al. Abundance of conserved CRISPR-Cas9 target sites within the highly polymorphic genomes of Anopheles and Aedes mosquitoes. Nature Communications. 11 (1), 1425 (2020).
- Schmidt, H., et al. Transcontinental dispersal of Anopheles gambiae occurred from West African origin via serial founder events. Communications Biology. 2, 473 (2019).
- Norris, L. C., et al. Adaptive introgression in an African malaria mosquito coincident with the increased usage of insecticide-treated bed nets. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (3), 815-820 (2015).
- Main, B. J., et al. The genetic basis of host preference and resting behavior in the major african malaria vector, Anopheles arabiensis. Plos Genetics. 12 (9), 1006303 (2016).
- Yamasaki, Y. K., et al. Improved tools for genomic DNA library construction of small insects. F1000Research. 5, 211 (2016).
- Tabuloc, C. A., et al. Sequencing of Tuta absoluta genome to develop SNP genotyping assays for species identification. Journal of Pest Science. 92, 1397-1407 (2019).
- Campos, M., et al. Complete mitogenome sequence of Anopheles coustani from São Tomé island. Mitochondrial DNA. Part B, Resources. 5 (3), 3376-3378 (2020).
- Cornel, A. J., et al. Complete mitogenome sequences of Aedes (Howardina) busckii and Aedes (Ochlerotatus) taeniorhynchus from the Caribbean Island of Saba. Mitochondrial DNA. Part B, Resources. 5 (2), 1163-1164 (2020).
- Lucena-Aguilar, G., et al. DNA source selection for downstream applications based on dna quality indicators analysis. Biopreservation and Biobanking. 14 (4), 264-270 (2016).
