En magnetisk perle-baseret Mosquito DNA ekstraktion protokol for næste generations sekventering
Summary
Beskrevet her er en DNA-ekstraktionsprotokol ved hjælp af magnetiske perler til at producere DNA-ekstraktioner af høj kvalitet fra myg. Disse ekstraktioner er velegnede til en downstream næste generations sekventeringsmetode.
Abstract
En nyligt offentliggjort DNA-ekstraktionsprotokol ved hjælp af magnetiske perler og et automatiseret DNA-ekstraktionsinstrument antydede, at det er muligt at udtrække DNA af høj kvalitet og mængde fra en velbevaret individuel myg, der er tilstrækkelig til downstream hele genomsekvensering. Afhængighed af et dyrt automatiseret DNA-ekstraktionsinstrument kan dog være uoverkommeligt for mange laboratorier. Her giver undersøgelsen en budgetvenlig magnetisk-perlebaseret DNA-ekstraktionsprotokol, som er velegnet til lav til medium gennemløb. Protokollen beskrevet her blev med succes testet ved hjælp af individuelle Aedes aegypti myg prøver. De reducerede omkostninger forbundet med dna-ekstraktion af høj kvalitet vil øge anvendelsen af høj gennemløbssekvensering på ressourcebegrænsede laboratorier og undersøgelser.
Introduction
Den seneste udvikling af en forbedret DNA-ekstraktionsprotokol1 har gjort det muligt at se mange undersøgelser af nedstrøms med stor effekt , der omfatter hele genomsekvensering2,3,4,5,6. Denne magnetiske perlebaserede DNA-ekstraktionsprotokol giver pålideligt DNA-udbytte fra individuelle mygprøver, hvilket igen reducerer omkostningerne og tiden forbundet med at erhverve et tilstrækkeligt antal prøver fra feltsamlinger.
De seneste fremskridt inden for befolknings- og landskabsgenomik hænger direkte sammen med faldende omkostninger ved helgenomsekvensering. Selvom den tidligere DNA-ekstraktionsprotokol1 øger effektiviteten forbundet med høj gennemløbssekvensering, kan mindre laboratorier / undersøgelser uden midler fravælge at bruge disse nye kraftfulde landskabs- og populationsgenomikværktøjer på grund af omkostningerne ved at implementere protokollen (f.eks. omkostninger til specialiserede instrumenter).
Her præsenteres en modificeret DNA-ekstraktionsprotokol, der bruger et lignende magnetisk perleekstraktionstrin som Neiman et al.1 for at opnå DNA med høj renhed, men ikke er afhængig af dyre instrumenter til væv lysis og DNA-ekstraktion. Denne protokol er velegnet til eksperimenter, der kræver >10 ng dna af høj kvalitet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den her beskrevne protokol kan tilpasses andre insektarter. Den oprindelige version af protokollen indført i Nieman et al.1 er blevet testet på flere arter, herunder Aedes aegypti, Ae. busckii, Ae. taeniorhynchus, Anopheles arabiensis, An. coluzzii, An. coustani, An. darlingi, An. funestus, An. gambiae, An. quadriannulatus, An. rufipes, Culex pipiens, Cx. quinquefasciatus, Cx. theileri, Drosophila suzukii, Chrysomela aeneicollis Tuta absoluta og Keiferia lycopersicella<sup clas…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi anerkender finansiering støtte fra Pacific Southwest Regional Center of Excellence for vektor-bårne sygdomme finansieret af den amerikanske Centers for Disease Control og Forebyggelse (Samarbejdsaftale 1U01CK000516), CDC tilskud NU50CK000420-04-04, USDA National Institute of Food and Agriculture (Hatch projekt 1025565), UF / IFAS Florida Medical Entomology Laboratory stipendium til Tse-Yu Chen, NSF CAMTech IUCRC Fase II tilskud (AWD05009_MOD0030), og Florida Department of Health (Kontrakt CODQJ). Resultaterne og konklusionerne i denne artikel er dem af forfatteren (r) og ikke nødvendigvis repræsenterer de synspunkter, som den amerikanske Fish and Wildlife Service.
Materials
| AE Buffer | Qiagen | 19077 | Elution buffer |
| AL Buffer | Qiagen | 19075 | Lysis buffer |
| AW1 Buffer | Qiagen | 19081 | Washing buffer 1 |
| AW2 Buffer | Qiagen | 19072 | Washing buffer 2 |
| MagAttract Suspension G | Qiagen | 1026901 | magnetic bead |
| Magnetic bead separator | Epigentek | Q10002-1 | |
| Nanodrop | ThermoFisher | ND-2000 | microvolume spectrophotometer |
| PK Buffer | ThermoFisher | 4489111 | Proteinase K buffer |
| Proteinase K | ThermoFisher | A25561 | |
| Qubit | Invitrogen | Q33238 | fluorometer |
Referências
- Nieman, C. C., Yamasaki, Y., Collier, T. C., Lee, Y. A DNA extraction protocol for improved DNA yield from individual mosquitoes. F1000Research. 4, 1314 (2015).
- Lee, Y., et al. Genome-wide divergence among invasive populations of Aedes aegypti in California. BMC Genomics. 20 (1), 204 (2019).
- Schmidt, H., et al. Abundance of conserved CRISPR-Cas9 target sites within the highly polymorphic genomes of Anopheles and Aedes mosquitoes. Nature Communications. 11 (1), 1425 (2020).
- Schmidt, H., et al. Transcontinental dispersal of Anopheles gambiae occurred from West African origin via serial founder events. Communications Biology. 2, 473 (2019).
- Norris, L. C., et al. Adaptive introgression in an African malaria mosquito coincident with the increased usage of insecticide-treated bed nets. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (3), 815-820 (2015).
- Main, B. J., et al. The genetic basis of host preference and resting behavior in the major african malaria vector, Anopheles arabiensis. Plos Genetics. 12 (9), 1006303 (2016).
- Yamasaki, Y. K., et al. Improved tools for genomic DNA library construction of small insects. F1000Research. 5, 211 (2016).
- Tabuloc, C. A., et al. Sequencing of Tuta absoluta genome to develop SNP genotyping assays for species identification. Journal of Pest Science. 92, 1397-1407 (2019).
- Campos, M., et al. Complete mitogenome sequence of Anopheles coustani from São Tomé island. Mitochondrial DNA. Part B, Resources. 5 (3), 3376-3378 (2020).
- Cornel, A. J., et al. Complete mitogenome sequences of Aedes (Howardina) busckii and Aedes (Ochlerotatus) taeniorhynchus from the Caribbean Island of Saba. Mitochondrial DNA. Part B, Resources. 5 (2), 1163-1164 (2020).
- Lucena-Aguilar, G., et al. DNA source selection for downstream applications based on dna quality indicators analysis. Biopreservation and Biobanking. 14 (4), 264-270 (2016).
