Ein magnetperlenbasiertes Moskito-DNA-Extraktionsprotokoll für die Sequenzierung der nächsten Generation
Summary
Hier wird ein DNA-Extraktionsprotokoll mit magnetischen Perlen beschrieben, um qualitativ hochwertige DNA-Extraktionen aus Moskitos herzustellen. Diese Extraktionen eignen sich für einen nachgelagerten Next-Generation-Sequencing-Ansatz.
Abstract
Ein kürzlich veröffentlichtes DNA-Extraktionsprotokoll mit magnetischen Perlen und einem automatisierten DNA-Extraktionsinstrument deutete darauf hin, dass es möglich ist, qualitativ hochwertige und quantitativ DNA aus einer gut erhaltenen einzelnen Mücke zu extrahieren, die für die nachgelagerte Sequenzierung des gesamten Genoms ausreicht. Die Abhängigkeit von einem teuren automatisierten DNA-Extraktionsinstrument kann jedoch für viele Labore unerschwinglich sein. Hier liefert die Studie ein budgetfreundliches magnetperlenbasiertes DNA-Extraktionsprotokoll, das für niedrigen bis mittleren Durchsatz geeignet ist. Das hier beschriebene Protokoll wurde erfolgreich mit einzelnen Aedes aegypti Mückenproben getestet. Die reduzierten Kosten, die mit einer qualitativ hochwertigen DNA-Extraktion verbunden sind, werden die Anwendung der Hochdurchsatzsequenzierung in ressourcenbeschmierten Laboren und Studien erhöhen.
Introduction
Die jüngste Entwicklung eines verbesserten DNA-Extraktionsprotokolls1 hat viele hochwirbende nachgelagerte Studien mit der Sequenzierung des gesamten Genoms2,3,4,5,6ermöglicht. Dieses auf magnetischen Perlen basierende DNA-Extraktionsprotokoll bietet eine zuverlässige DNA-Ausbeute aus einzelnen Mückenproben, was wiederum die Kosten und den Zeitaufwand reduziert, die mit der Gewinnung einer ausreichenden Anzahl von Proben aus Feldsammlungen verbunden sind.
Jüngste Fortschritte in der Populations- und Landschaftsgenomik stehen in direktem Zusammenhang mit sinkenden Kosten für die Sequenzierung des gesamten Genoms. Obwohl das vorherige DNA-Extraktionsprotokoll1 die Effizienz im Zusammenhang mit der Hochdurchsatzsequenzierung erhöht, können kleinere Labore / Studien ohne die Mittel die Verwendung dieser neuen leistungsstarken Landschafts- und Populationsgenomik-Tools aufgrund der Kosten für die Implementierung des Protokolls (z. B. Kosten für spezialisierte Instrumente) ablehnen.
Hier wird ein modifiziertes DNA-Extraktionsprotokoll vorgestellt, das einen ähnlichen magnetischen Perlenextraktionsschritt wie Neiman et al.1 verwendet, um hochreine DNA zu erhalten, aber nicht auf kostenintensive Instrumente für die Gewebelyse und DNA-Extraktion angewiesen ist. Dieses Protokoll eignet sich für Experimente, die >10 ng hochwertiger DNA erfordern.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das hier beschriebene Protokoll kann für andere Insektenarten angepasst werden. Die ursprüngliche Version des in Nieman et al.1 eingeführten Protokolls wurde an mehreren Arten getestet, darunter Aedes aegypti, Ae. busckii, Ae. taeniorhynchus, Anopheles arabiensis, An. coluzzii, An. coustani, An. darlingi, An. funestus, An. gambiae, An. quadriannulatus, An. rufipes, Culex pipiens, Cx. quinquefasciatus, Cx. theileri, Drosophila suzukii, Chrysomela aeneicollis Tuta absoluta und Keifer…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken für die finanzielle Unterstützung durch das Pacific Southwest Regional Center of Excellence for Vector-Borne Diseases, das von den U.S. Centers for Disease Control and Prevention (Cooperative Agreement 1U01CK000516), cdc grant NU50CK000420-04-04,04, dem USDA National Institute of Food and Agriculture (Hatch project 1025565), UF/IFAS Florida Medical Entomology Laboratory Fellowship an Tse-Yu Chen, NSF CAMTech IUCRC Phase II Grant (AWD05009_MOD0030) und Florida Department of Health (Contract CODQJ) finanziert wird. Die Ergebnisse und Schlussfolgerungen in diesem Artikel sind die des Autors /der Autoren und geben nicht unbedingt die Ansichten des U.S. Fish and Wildlife Service an.
Materials
| AE Buffer | Qiagen | 19077 | Elution buffer |
| AL Buffer | Qiagen | 19075 | Lysis buffer |
| AW1 Buffer | Qiagen | 19081 | Washing buffer 1 |
| AW2 Buffer | Qiagen | 19072 | Washing buffer 2 |
| MagAttract Suspension G | Qiagen | 1026901 | magnetic bead |
| Magnetic bead separator | Epigentek | Q10002-1 | |
| Nanodrop | ThermoFisher | ND-2000 | microvolume spectrophotometer |
| PK Buffer | ThermoFisher | 4489111 | Proteinase K buffer |
| Proteinase K | ThermoFisher | A25561 | |
| Qubit | Invitrogen | Q33238 | fluorometer |
Referências
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