Un protocollo di estrazione del DNA delle zanzare a base di perline magnetiche per il sequenziamento di nuova generazione
Summary
Qui descritto è un protocollo di estrazione del DNA che utilizza perline magnetiche per produrre estrazioni di DNA di alta qualità dalle zanzare. Queste estrazioni sono adatte per un approccio di sequenziamento di nuova generazione a valle.
Abstract
Un protocollo di estrazione del DNA recentemente pubblicato che utilizza perline magnetiche e uno strumento automatizzato di estrazione del DNA hanno suggerito che è possibile estrarre DNA di alta qualità e quantità da una zanzara individuale ben conservata sufficiente per il sequenziamento dell’intero genoma a valle. Tuttavia, la dipendenza da un costoso strumento automatizzato di estrazione del DNA può essere proibitiva per molti laboratori. Qui, lo studio fornisce un protocollo di estrazione del DNA basato su perline magnetiche budget-friendly, adatto per una produttività da bassa a media. Il protocollo qui descritto è stato testato con successo utilizzando singoli campioni di zanzare Aedes aegypti. La riduzione dei costi associati all’estrazione del DNA di alta qualità aumenterà l’applicazione del sequenziamento ad alta produttività a laboratori e studi limitati alle risorse.
Introduction
Il recente sviluppo di un protocollo di estrazione del DNAmigliorato 1 ha permesso molti studi a valle ad alto impatto che coinvolgono il sequenziamento dell’interogenoma 2,3,4,5,6. Questo protocollo di estrazione del DNA basato su perline magnetiche fornisce una resa affidabile del DNA da singoli campioni di zanzara, che a sua volta riduce il costo e il tempo associati all’acquisizione di un numero sufficiente di campioni dalle raccolte sul campo.
I recenti progressi nella genomica della popolazione e del paesaggio sono direttamente correlati con la diminuzione dei costi del sequenziamento dell’intero genoma. Sebbene il precedente protocollo di estrazione del DNA1 aumenti l’efficienza associata al sequenziamento ad alta produttività, laboratori / studi più piccoli senza i fondi possono scegliere di non utilizzare questi nuovi potenti strumenti genomici per il paesaggio e la popolazione a causa dei costi di implementazione del protocollo (ad esempio, i costi degli strumenti specializzati).
Qui viene presentato un protocollo di estrazione del DNA modificato che utilizza una fase di estrazione del tallone magnetico simile a Quella di Neiman etal. Questo protocollo è adatto per esperimenti che richiedono >10 ng di DNA di alta qualità.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il protocollo qui descritto può essere adattato per altre specie di insetti. La versione originale del protocollo introdotto in Nieman etal. An. coustani, An. darlingi, An. funestus, An. gambiae, An. quadriannulatus, An. rufipes, Culex pipiens, Cx. quinquefasciatus, Cx. theileri, Drosophila suzukii, Chrysomela aeneicollis Tuta absoluta e Keiferia lycopersicella2,8,9,<sup cla…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Riconosciamo il sostegno finanziario del Pacific Southwest Regional Center of Excellence for Vector-Borne Diseases finanziato dai Centri statunitensi per il controllo e la prevenzione delle malattie (Accordo di cooperazione 1U01CK000516), sovvenzione CDC NU50CK000420-04-04, l’USDA National Institute of Food and Agriculture (Hatch project 1025565), la borsa di studio UF/IFAS Florida Medical Entomology Laboratory a Tse-Yu Chen, la sovvenzione NSF CAMTech IUCRC Phase II (AWD05009_MOD0030) e il Florida Department of Health (Contract CODQJ). I risultati e le conclusioni di questo articolo sono quelli dell’autore o degli autori e non rappresentano necessariamente le opinioni del Servizio pesce e fauna selvatica degli Stati Uniti.
Materials
| AE Buffer | Qiagen | 19077 | Elution buffer |
| AL Buffer | Qiagen | 19075 | Lysis buffer |
| AW1 Buffer | Qiagen | 19081 | Washing buffer 1 |
| AW2 Buffer | Qiagen | 19072 | Washing buffer 2 |
| MagAttract Suspension G | Qiagen | 1026901 | magnetic bead |
| Magnetic bead separator | Epigentek | Q10002-1 | |
| Nanodrop | ThermoFisher | ND-2000 | microvolume spectrophotometer |
| PK Buffer | ThermoFisher | 4489111 | Proteinase K buffer |
| Proteinase K | ThermoFisher | A25561 | |
| Qubit | Invitrogen | Q33238 | fluorometer |
Referências
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