Um protocolo de extração de DNA de mosquito baseado em contas magnéticas para sequenciamento de próxima geração
Summary
Descrito aqui é um protocolo de extração de DNA usando contas magnéticas para produzir extrações de DNA de alta qualidade de mosquitos. Essas extrações são adequadas para uma abordagem de sequenciamento de próxima geração a jusante.
Abstract
Um protocolo de extração de DNA recentemente publicado usando contas magnéticas e um instrumento automatizado de extração de DNA sugeriu que é possível extrair DNA de alta qualidade e quantidade de um mosquito individual bem preservado suficiente para sequenciamento de genoma a jusante. No entanto, a dependência de um caro instrumento automatizado de extração de DNA pode ser proibitiva para muitos laboratórios. Aqui, o estudo fornece um protocolo de extração de DNA baseado em contas magnéticas, que é adequado para baixo a médio rendimento. O protocolo descrito aqui foi testado com sucesso utilizando amostras individuais do mosquito Aedes aegypti. Os custos reduzidos associados à extração de DNA de alta qualidade aumentarão a aplicação de sequenciamento de alto rendimento a laboratórios e estudos limitados de recursos.
Introduction
O desenvolvimento recente de um protocolo de extração de DNAmelhorado 1 permitiu muitos estudos de alto impacto a jusante envolvendo sequenciamento de genoma inteiro2,3,4,5,6. Este protocolo de extração de DNA baseado em contas magnéticas fornece um rendimento de DNA confiável de amostras individuais de mosquitos, o que, por sua vez, reduz o custo e o tempo associados à aquisição de um número suficiente de amostras de coleções de campo.
Os recentes avanços na genômica populacional e paisagística estão diretamente correlacionados com a diminuição dos custos de sequenciamento de genomas inteiros. Embora o protocolo anterior de extração de DNA1 aumente a eficiência associada ao sequenciamento de alto rendimento, laboratórios/estudos menores sem os fundos podem optar por não usar essas novas poderosas ferramentas de genômica paisagística e populacional devido aos custos de implementação do protocolo (por exemplo, custos de instrumentos especializados).
Aqui, é apresentado um protocolo de extração de DNA modificado que usa um passo de extração de contas magnéticas semelhante ao Neiman et al.1 para obter DNA de alta pureza, mas não conta com instrumentos de alto custo para lise tecidual e extração de DNA. Este protocolo é adequado para experimentos que exigem >10 ng de DNA de alta qualidade.
Protocol
Representative Results
Discussion
O protocolo descrito aqui pode ser adaptado para outras espécies de insetos. A versão original do protocolo introduzido em Nieman et al.1 foi testada em várias espécies, incluindo Aedes aegypti, Ae. busckii, Ae. taeniorhynchus, Anopheles arabiensis, An. coluzzii, An. coustani, An. darlingi, An. funestus, An. gambiae, An. quadriannulatus, An. rufipes, Culex pipiens, Cx. quinquefasciatus, Cx. theileri, Drosophila suzukii, Chrysomela aeneicollis Tuta absoluta, e Keiferia lycopersicel…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Reconhecemos o apoio financeiro do Centro Regional de Excelência para Doenças Transmitidas por Vetores do Pacífico financiado pelos Centros de Controle e Prevenção de Doenças dos EUA (Acordo Cooperativo 1U01CK000516), cdc conceder NU50CK000420-04-04, o USDA National Institute of Food and Agriculture (Projeto Hatch 1025565), uf/IFAS Florida Medical Entomology Laboratory fellowship to Tse-Yu Chen, NSF CAMTech IUCRC Phase II grant (AWD05009_MOD0030) e Florida Department of Health (Contract CODQJ). As conclusões e conclusões deste artigo são dos autores e não representam necessariamente as opiniões do Serviço de Pesca e Vida Selvagem dos EUA.
Materials
| AE Buffer | Qiagen | 19077 | Elution buffer |
| AL Buffer | Qiagen | 19075 | Lysis buffer |
| AW1 Buffer | Qiagen | 19081 | Washing buffer 1 |
| AW2 Buffer | Qiagen | 19072 | Washing buffer 2 |
| MagAttract Suspension G | Qiagen | 1026901 | magnetic bead |
| Magnetic bead separator | Epigentek | Q10002-1 | |
| Nanodrop | ThermoFisher | ND-2000 | microvolume spectrophotometer |
| PK Buffer | ThermoFisher | 4489111 | Proteinase K buffer |
| Proteinase K | ThermoFisher | A25561 | |
| Qubit | Invitrogen | Q33238 | fluorometer |
Referências
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