Un protocolo de extracción de ADN de mosquitos a base de perlas magnéticas para la secuenciación de próxima generación
Summary
Aquí se describe un protocolo de extracción de ADN que utiliza perlas magnéticas para producir extracciones de ADN de alta calidad de mosquitos. Estas extracciones son adecuadas para un enfoque de secuenciación de próxima generación aguas abajo.
Abstract
Un protocolo de extracción de ADN recientemente publicado utilizando perlas magnéticas y un instrumento automatizado de extracción de ADN sugirió que es posible extraer ADN de alta calidad y cantidad de un mosquito individual bien conservado suficiente para la secuenciación del genoma completo aguas abajo. Sin embargo, la dependencia de un costoso instrumento automatizado de extracción de ADN puede ser prohibitiva para muchos laboratorios. Aquí, el estudio proporciona un protocolo de extracción de ADN basado en perlas magnéticas económico, que es adecuado para un rendimiento bajo a medio. El protocolo descrito aquí se probó con éxito utilizando muestras individuales de mosquitos Aedes aegypti. Los costos reducidos asociados con la extracción de ADN de alta calidad aumentarán la aplicación de la secuenciación de alto rendimiento a laboratorios y estudios de recursos limitados.
Introduction
El desarrollo reciente de un protocolo mejorado de extracción de ADN1 ha permitido muchos estudios posteriores de alto impacto que involucran la secuenciación delgenoma completo2,3,4,5,6. Este protocolo de extracción de ADN basado en perlas magnéticas proporciona un rendimiento de ADN confiable de muestras individuales de mosquitos, lo que a su vez reduce el costo y el tiempo asociados con la adquisición de un número suficiente de muestras de colecciones de campo.
Los avances recientes en la genómica de la población y el paisaje están directamente correlacionados con la disminución de los costos de la secuenciación del genoma completo. Aunque el protocolo de extracción de ADN1 anterior aumenta las eficiencias asociadas con la secuenciación de alto rendimiento, los laboratorios / estudios más pequeños sin los fondos pueden optar por no usar estas nuevas y poderosas herramientas de genómica de poblaciones y paisajes debido a los costos de implementación del protocolo (por ejemplo, los costos de los instrumentos especializados).
Aquí, se presenta un protocolo de extracción de ADN modificado que utiliza un paso de extracción de perlas magnéticas similar al de Neiman et al.1 para obtener ADN de alta pureza, pero no depende de instrumentos de alto costo para la lisis tisular y la extracción de ADN. Este protocolo es adecuado para experimentos que requieren >10 ng de ADN de alta calidad.
Protocol
Representative Results
Discussion
El protocolo descrito aquí se puede adaptar para otras especies de insectos. La versión original del protocolo introducido en Nieman et al.1 ha sido probada en múltiples especies, incluyendo Aedes aegypti, Ae. busckii, Ae. taeniorhynchus, Anopheles arabiensis, An. coluzzii, An. coustani, An. darlingi, An. funestus, An. gambiae, An. quadriannulatus, An. rufipes, Culex pipiens, Cx. quinquefasciatus, Cx. theileri, Drosophila suzukii, Chrysomela aeneicollis Tuta absoluta, y Keiferia ly…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Reconocemos el apoyo financiero del Centro Regional de Excelencia para Enfermedades Transmitidas por Vectores del Suroeste del Pacífico financiado por los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades de los Estados Unidos (Acuerdo de Cooperación 1U01CK000516), la subvención nu50CK000420-04-04 del CDC, el Instituto Nacional de Alimentación y Agricultura del USDA (proyecto Hatch 1025565), la beca del Laboratorio de Entomología Médica de Florida de la UF/IFAS para Tse-Yu Chen, la subvención NSF CAMTech IUCRC Fase II (AWD05009_MOD0030) y el Departamento de Salud de Florida (Contrato CODQJ). Los hallazgos y conclusiones de este artículo son los de los autores y no representan necesariamente los puntos de vista del Servicio de Pesca y Vida Silvestre de los Estados Unidos.
Materials
| AE Buffer | Qiagen | 19077 | Elution buffer |
| AL Buffer | Qiagen | 19075 | Lysis buffer |
| AW1 Buffer | Qiagen | 19081 | Washing buffer 1 |
| AW2 Buffer | Qiagen | 19072 | Washing buffer 2 |
| MagAttract Suspension G | Qiagen | 1026901 | magnetic bead |
| Magnetic bead separator | Epigentek | Q10002-1 | |
| Nanodrop | ThermoFisher | ND-2000 | microvolume spectrophotometer |
| PK Buffer | ThermoFisher | 4489111 | Proteinase K buffer |
| Proteinase K | ThermoFisher | A25561 | |
| Qubit | Invitrogen | Q33238 | fluorometer |
Referências
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