Ett magnetiskt pärlbaserat mygg-DNA-extraktionsprotokoll för nästa generations sekvensering
Summary
Beskrivs här är ett DNA-extraktionsprotokoll med magnetiska pärlor för att producera högkvalitativa DNA-extraktioner från myggor. Dessa extraktioner är lämpliga för en nedströms nästa generations sekvenseringsmetod.
Abstract
Ett nyligen publicerat DNA-extraktionsprotokoll med magnetiska pärlor och ett automatiserat DNA-extraktionsinstrument föreslog att det är möjligt att extrahera högkvalitativt och mängd-DNA från en välbevarad individuell mygga som är tillräcklig för nedströms hel genomsekvensering. Att förlita sig på ett dyrt automatiserat DNA-extraktionsinstrument kan dock vara oöverkomligt för många laboratorier. Här ger studien ett budgetvänligt magnetiskt pärlbaserat DNA-extraktionsprotokoll, som är lämpligt för låg till medelhög genomströmning. Protokollet som beskrivs här testades framgångsrikt med hjälp av enskilda Aedes aegypti myggprover. De minskade kostnaderna i samband med DNA-extraktion av hög kvalitet kommer att öka tillämpningen av hög genomströmningssekvensering på resursbegränsade laboratorier och studier.
Introduction
Den senaste utvecklingen av ett förbättratDNA-extraktionsprotokoll 1 har möjlig tillåtit många nedströmsstudier som involverar helagenomsekvensering 2,3,4,5,6. Detta magnetiska pärlbaserade DNA-extraktionsprotokoll ger tillförlitlig DNA-avkastning från enskilda myggprover, vilket i sin tur minskar kostnaden och tiden i samband med att förvärva ett tillräckligt antal prover från fältsamlingar.
Den senaste tidens framsteg inom befolknings- och landskapsgenomik korreleras direkt med minskande kostnader för hela genomsekvensering. Även om det tidigareDNA-extraktionsprotokollet 1 ökar effektiviteten i samband med sekvensering med hög genomströmning, kan mindre laboratorier /studier utan medel välja bort att använda dessa nya kraftfulla landskaps- och befolkningsgenomikverktyg på grund av kostnader för att implementera protokollet (t.ex. kostnader för specialiserade instrument).
Här presenteras ett modifierat DNA-extraktionsprotokoll som använder ett liknande magnetiskt pärlextraktionssteg som Neiman et al.1 för att erhålla DNA med hög renhet men inte förlitar sig på högkostnadsinstrument för vävnadslys och DNA-extraktion. Detta protokoll är lämpligt för experiment som > 10 ng högkvalitativt DNA.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollet som beskrivs här kan anpassas för andra insektsarter. Den ursprungliga versionen av protokollet som infördes i Nieman et al.1 har testats på flera arter, inklusive Aedes aegypti, Ae. busckii, Ae. taeniorhynchus, Anopheles arabiensis, An. coluzzii, An. coustani, An. darlingi, An. funestus, An. gambiae, An. quadriannulatus, An. rufipes, Culex pipiens, Cx. quinquefasciatus, Cx. theileri, Drosophila suzukii, Chrysomela aeneicollis Tuta absoluta och Keiferia lycopersicella…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi bekräftar finansieringsstöd från Pacific Southwest Regional Center of Excellence for Vector-Borne Diseases finansierat av U.S. Centers for Disease Control and Prevention (Cooperative Agreement 1U01CK000516), CDC beviljar NU50CK000420-04-04, USDA National Institute of Food and Agriculture (Hatch Project 1025565), UF/IFAS Florida Medical Entomology Laboratory fellowship to Tse-Yu Chen, NSF CAMTech IUCRC Phase II grant (AWD05009_MOD0030) och Florida Department of Health (Contract CODQJ). Resultaten och slutsatserna i denna artikel är författarens och representerar inte nödvändigtvis synpunkterna från U.S. Fish and Wildlife Service.
Materials
| AE Buffer | Qiagen | 19077 | Elution buffer |
| AL Buffer | Qiagen | 19075 | Lysis buffer |
| AW1 Buffer | Qiagen | 19081 | Washing buffer 1 |
| AW2 Buffer | Qiagen | 19072 | Washing buffer 2 |
| MagAttract Suspension G | Qiagen | 1026901 | magnetic bead |
| Magnetic bead separator | Epigentek | Q10002-1 | |
| Nanodrop | ThermoFisher | ND-2000 | microvolume spectrophotometer |
| PK Buffer | ThermoFisher | 4489111 | Proteinase K buffer |
| Proteinase K | ThermoFisher | A25561 | |
| Qubit | Invitrogen | Q33238 | fluorometer |
Referências
- Nieman, C. C., Yamasaki, Y., Collier, T. C., Lee, Y. A DNA extraction protocol for improved DNA yield from individual mosquitoes. F1000Research. 4, 1314 (2015).
- Lee, Y., et al. Genome-wide divergence among invasive populations of Aedes aegypti in California. BMC Genomics. 20 (1), 204 (2019).
- Schmidt, H., et al. Abundance of conserved CRISPR-Cas9 target sites within the highly polymorphic genomes of Anopheles and Aedes mosquitoes. Nature Communications. 11 (1), 1425 (2020).
- Schmidt, H., et al. Transcontinental dispersal of Anopheles gambiae occurred from West African origin via serial founder events. Communications Biology. 2, 473 (2019).
- Norris, L. C., et al. Adaptive introgression in an African malaria mosquito coincident with the increased usage of insecticide-treated bed nets. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (3), 815-820 (2015).
- Main, B. J., et al. The genetic basis of host preference and resting behavior in the major african malaria vector, Anopheles arabiensis. Plos Genetics. 12 (9), 1006303 (2016).
- Yamasaki, Y. K., et al. Improved tools for genomic DNA library construction of small insects. F1000Research. 5, 211 (2016).
- Tabuloc, C. A., et al. Sequencing of Tuta absoluta genome to develop SNP genotyping assays for species identification. Journal of Pest Science. 92, 1397-1407 (2019).
- Campos, M., et al. Complete mitogenome sequence of Anopheles coustani from São Tomé island. Mitochondrial DNA. Part B, Resources. 5 (3), 3376-3378 (2020).
- Cornel, A. J., et al. Complete mitogenome sequences of Aedes (Howardina) busckii and Aedes (Ochlerotatus) taeniorhynchus from the Caribbean Island of Saba. Mitochondrial DNA. Part B, Resources. 5 (2), 1163-1164 (2020).
- Lucena-Aguilar, G., et al. DNA source selection for downstream applications based on dna quality indicators analysis. Biopreservation and Biobanking. 14 (4), 264-270 (2016).
