Hier bieten wir ein Schritt-für-Schritt-Protokoll mit Tipps zur Generierung von Xenografts und Richtlinien für die Tumorverhaltensanalyse, die Immunfluoreszenz mit voller Montätralisierung und die konfokale Bildgebungsquantifizierung.
Zebrafisch Larven Xenografts sind weit verbreitet für die Krebsforschung verwendet, um in vivo und Echtzeit-Studien über menschlichen Krebs durchzuführen. Die Möglichkeit, die Reaktion auf Krebstherapien (Chemo, Strahlentherapie und BiologischeS), Angiogenese und Metastasen mit einzelliger Auflösung schnell zu visualisieren, stellt das Zebrafisch-Xenograft-Modell als Top-Wahl für die Entwicklung präklinischer Studien.
Der Zebrafisch Larven-Xenograft-Assay bietet mehrere experimentelle Vorteile im Vergleich zu anderen Modellen, aber wahrscheinlich ist der auffälligste die Reduzierung der Größe Skala und folglich Zeit. Diese Reduzierung der Skala ermöglicht einzellige Bildgebung, die Verwendung einer relativ geringen Anzahl von menschlichen Zellen (kompatibel mit Biopsien), mittel-hohen Durchsatz-Arzneimittel-Screenings, aber vor allem ermöglicht eine signifikante Verkürzung der Zeit des Assays. All diese Vorteile machen den Zebrafisch Xenograft Assay extrem attraktiv für zukünftige personalisierte Medizinanwendungen.
Viele Zebrafisch Xenograft Protokolle wurden mit einer großen Vielfalt von menschlichen Tumoren entwickelt; Ein allgemeines und standardisiertes Protokoll zur effizienten Erzeugung von Zebrafischlarven-Xenografts fehlt jedoch noch. Hier bieten wir ein Schritt-für-Schritt-Protokoll mit Tipps zur Generierung von Xenografts und Richtlinien für die Tumorverhaltensanalyse, die Immunfluoreszenz mit vollwertigen Modulen und die konfokale Bildgebungsquantifizierung.
Zebrafische (Danio rerio) entwickeln sich zu einem mächtigen Wirbeltiermodell, um Entwicklung und Krankheit zu untersuchen. Zebrafish hat hochkonservierte genetische Merkmale (70 % genetische Homologie und 84 % krankheitsbedingte Gene) und grundlegende organmorphologische Merkmale mit dem Menschen1,2. Diese Konservierung ermöglicht die Verwendung von Zebrafischen, um mehrere menschliche Krankheiten zu modellieren, einschließlich Krebs3,4.
Die Handhabung und Wartung von Zebrafischen ist viel einfacher und kostengünstiger als Mäuse aufgrund ihrer geringen Größe, hohe Fruchtbarkeit das ganze Jahr über und externe Düngung3,5. Zebrafisch-Embryonen benötigen keine live-Fütterung während ihrer ersten 5-7 Tage des Lebens und wurden als effektives Modell für Entwicklung, Infektion und Krebsverwendet 1,4,6,7. Zebrafisch-Embryonen schlüpfen 48 Stunden nach der Befruchtung (hpf) und sind freischwimmende Tiere mit allen Organen gebildet, ein schlagendes Herz und funktionelles Kreislaufsystem, Leber, Gehirn, Nierenmark, etc.1,3. Auch in diesem Stadium der Entwicklung ist nur angeborene Immunität im Spiel, adaptive Immunität ist immer noch entwicklung, so dass eine allgemeine effiziente Transplantation von menschlichen Zellen ohne Notwendigkeit für die Verwendung von immungeschwächten Mutanten7,8. Dennoch ist es wichtig zu beachten, dass nicht alle menschlichen Zellen gleich9 engraft werden und dassz.B.bei Leukämiezellen gezeigt wurde, dass Phagozyten (Neutrophile und Makrophagen) für eine effiziente Engraftmentierung erschöpft werden müssen 10 .
Die genetische Traktionsfähigkeit des Zebrafischs und die optische Transparenz seiner frühen embryonalen Stadien ermöglichen eine intravitale Einzelzellbildgebung mit hoher Auflösung und damit die Etablierung modernster Bildgebungstechniken in verschiedenen Bereichen der Biologie. Darüber hinaus sind diese Merkmale im Zusammenhang mit Krebs nützlich für Echtzeitstudien der frühesten Stadien von Wirtstumor-Wechselwirkungen, wie die Untersuchung des angiogenen und metastasierenden Potenzials, sowie Interaktionen mit dem angeborenen Immunsystem8,9,11,12,13.
Obwohl im kurzen Xenograft-Test keine Zeit für metastasierende “Evolution” bleibt- ist es möglich, die metastasierende Kapazität der Tumorzellen zu analysieren (d.h. ihre Effizienz, durch metastasierende Schritte wie Invasion, Intravasation, Überleben im Kreislauf, Extravasation und Kolonisation zu gehen und daher diese Prozesse in vivo und in Echtzeit8,11,13,14)zu untersuchen.
Die Eigenschaften seines Lebenszyklus stellen den Zebrafisch als einzigartiges Modell für die personalisierte Medizin bei Krebs. Assays können in einer kürzeren Zeitspanne durchgeführt werden und Ergebnisse erhalten in ein paar Wochen7,8,9,11,12,15,16. Die Höhe und Durchführbarkeit dieser Assays bieten Ärzten und Forschern die Möglichkeit, translationale Ergebnisse zu erhalten, die für Krebspatienten nützlich sein können, für die Zeit ein wesentliches Bedürfnis ist.
Trotz der zunehmenden Versuche, erfolgreiche Zebrafisch-Embryo-Xenografts zu erzeugen, besteht nach wie vor Bedarf an der Standardisierung des Injektionsverfahrens sowie der Bewertung der Zelllebensfähigkeit und des Tumorverhaltens nach der Injektion.
In diesem Protokoll bieten wir Forschern eine klare und detaillierte Schritt-für-Schritt-Anleitung für die Injektion menschlicher Krebszelllinien in Zebrafischembryonen und anschließende Fixierung, Immunostainierung, Bildgebung und Quantifizierung des Tumorzellverhaltens.
Die zunehmende Bedeutung des Zebrafisches als Modell für die Krebsentwicklung und das Arzneimittelscreening hat zu zahlreichen Publikationen3,4,7,13,14,16,18,19,20,21geführt. Die Injektion von Krebszellen in Zebrafisch-Embryonen ist jedoch eine Technik, die ein hohes Maß an Geschicklichkeit erfordert, das für Forscher eine Herausforderung sein kann. In diesem Protokoll wollen wir praktische Informationen und einige Tipps geben, die helfen können, die anfänglichen Herausforderungen bei der Einrichtung von Zebrafisch-Embryo-Xenografts zu meistern.
Zellhandling vor der Injektion
Dieses optimierte Protokoll für die Erzeugung von Zebrafisch-Xenografts mit Zelllinien kann an verschiedene Arten von (Krebs-)Zellen mit unterschiedlichen Morphologien angepasst werden. Wir empfehlen, dass alle Zelllinien, die für Zebrafisch-Xenografts verwendet werden, mykoplasmafrei sind. Im Gegensatz zu anderen bakteriellen Verunreinigungen erzeugt das Vorhandensein von Mykoplasmen in der Zellkultur keine Veränderungen, die leicht unter dem Mikroskop erkannt werden können22. Mykoplasmenkontamination kann das Transplantationspotenzial der Zelllinien, ihre Empfindlichkeit gegenüber Medikamenten sowie die Lebensfähigkeit der Zebrafischembryonen beeinträchtigen.
Obwohl sich Zellen über einen längeren Zeitraum weiter ausbreiten können, können ihr Phänotyp und Ihr Genotyp anfällig für Veränderungen sein. Es ist wichtig, sich mit der Morphologie und dem Verhalten der Zelllinien in der Kultur vertraut zu machen. Wir empfehlen, die Anzahl der Zellpassagen nach dem Auftauen zwischen 3-12 zu halten, um reproduzierbare Ergebnisse zu erhalten. Daher sollten regelmäßige Mykoplasmentests durchgeführt werden.
Die Zellen sollten sich in ihrer Logphase befinden (exponentielle Wachstumsphase vor Erreichen des Zusammenflusses von 70 %) am Tag der Injektion. Dies wird eine angemessene Transplantation und richtige Entwicklung der unverwechselbaren Merkmale des Tumors ermöglichen. Um Eine Variation des Phänotyps von Zellen innerhalb des Xenografts zu verhindern, ist es wichtig, den Zusammenfluss für Injektionskonstanten zwischen den Experimenten beizubehalten. Die Anzahl der injizierten Zellen kann an die Eigenschaften jeder Zelllinie angepasst werden, da einige höhere Injektionsdichten erfordern können, um in den Zebrafischembryonen gedeihen zu können.
Überlegungen zur Zellkennzeichnung
Um menschliche Tumorzellen für die Injektion und zukünftige Analyse besser zu visualisieren, können Tumorzellen mit fluoreszierenden Farbstoffen gekennzeichnet werden. Aufgrund von Unterschieden in der Zellgröße variiert die Gesamtzahl der Zellen/cm2 in anhaftenden Kulturen zwischen den Zelllinien. Dies wirkt sich auf die Wirksamkeit des Färbeprotokolls sowie auf die Anzahl der zur Injektion geernteten Zellen aus. Große Zellen, die niedrige Zahlen pro Kolben (d. h. Hs578T) liefern oder in Clustern wachsen (d. h. BFTC905), erfordern das Zusammenführen mehrerer Kolben für ein einzelnes Experiment. In diesem Fall sollte die Färbung von Zellen nicht direkt im Kolben durchgeführt werden, da dies die Verwendung von übermäßigen Mengen an Farbstoff (hohe Kosten) verursachen wird. Andererseits können Zellen, die sehr empfindlich auf übermäßige Zentrifugationszyklen reagieren, sowie solche, die hohe Zahlen pro Kolben ergeben (d. h. HCT116), direkt im Kolben befleckt und dann mit EDTA/Zellschaber abgelöst werden (weitere Informationen siehe Tabelle 1).
Wenn möglich, verwenden Sie EDTA, anstatt einen enzymatischen Ansatz zu verwenden, um die Zellen am Tag der Injektion zu lösen, so dass Zellen ihre Zell-Zell-Verbindungen schneller wiederherstellen und weniger Zentrifugationsschritten ausgesetzt sind. Wenn die Zellen jedoch empfindlich auf EDTA reagieren, sehr haftend sind oder in Clustern wachsen , kann eine enzymatische Methode angewendet werden. Die Optimierung der idealen Injektionskonzentration sowie des Injektionsmediums hängt von den Eigenschaften jeder Zelllinie ab, so dass einige Anpassungen erforderlich sein könnten (Tabelle 1).
Mikroinjektionskalibrierung
Im Gegensatz zur Abgabe von Oligonukleotiden oder Medikamenten in den Zebrafisch-Embryo wird ein Graticule nicht verwendet, um die Nadel bei der Arbeit mit Zelllinien für Xenografts zu kalibrieren. Nach einiger Zeit während der Injektion beginnen die Zellen zu verstopfen, und es ist notwendig, die Spitze der Nadel zu schneiden, um ihren Durchmesser zu erhöhen oder die Nadel vollständig zu ändern. Dieses Verfahren behindert die Gitterrifikulationskalibrierung.
Um dieses Problem zu lösen, wird die Anzahl der abgegebenen Zellen durch Auswurfdruck und Zeit, die benötigt wird, um eine Größe ähnlich dem Embryoauge innerhalb von 1-3 Impulsen zu erreichen, reguliert. Um die Tumorgröße weiter zu kontrollieren, werden bei 1 dpi Xenografts nach der Tumorgröße sortiert, wie in Abbildung 6 B-B”dargestellt. Wie in Abbildung 6C dargestellt, ist diese Methode der Sortierung effizient bei der Verringerung der Variation der Tumorgrößen: Wenn wir sie alle zusammen bündeln (+, ++, +++), ist der STEV das Doppelte der ++-Klasse (906 Zellen auf 422 Zellen) und die Koeffizientenvariation beträgt 31,9 % im Vergleich zu 14,5 % in der ++-Klasse. Da der Referenzwert für die Injektion Volumen ist, variiert die Gesamtzahl der Zellen stark zwischen den Zelltypen – abhängig von der Größe und Form der Zellen. Zum Beispiel produzieren große Zellen mit viel Zytoplasma wie Brustkrebs Hs578T viel kleinere Tumoren (ca. 600 Zellen). Außerdem erfordert jede Zelllinie eine unterschiedliche Anzahl von Zellen. Zum Beispiel haben die Harnblasenzelllinien HT29 CRC und RT112 gezeigt, dass je höher die Anzahl der injizierten Zellen, desto höher die Zebrafischsterblichkeit. Daher ist eine Phase der Optimierung während der Entwicklung der Xenografts erforderlich, um zu testen, ob die Zelllinie toxische Wirkungen im Embryo hat oder höhere/niedrigere Injektionsdichten erfordert.
Injektionsstelle
Eine der häufigsten Diskrepanzen bei der Erzeugung von Zebrafisch-Embryo-Xenografts ist die Injektionsstelle. Das Eigelb ist in der Regel der Ort der Wahl für die Injektion aufgrund seiner einfachen Zugänglichkeit. Wir haben jedoch beobachtet, dass Zellen, die in das Eigelb injiziert werden, eine höhere Neigung zum Absterben haben. Obwohl technisch schwieriger, empfehlen wir, in die PVS und so weit wie möglich aus dem Herzen zu injizieren. Innerhalb der PVS können Zellen aggregieren, Gefäße und Immunzellen rekrutieren und migrieren, intravasieren, extravasatieren und Mikrometastasen bilden, wenn sie metastasierende Eigenschaften aufweisen8,11.
Effizienz der Transplantation
Unterschiede in der Transplantationseffizienz und Tumorgröße zwischen Zelllinien bei 4 dpi werden aufgrund ihres unterschiedlichen Grades an Basalzelltod/-überleben/-proliferation, aber auch aufgrund der angeborenen Immunogenität erwartet, die jede Zelllinie9anzeigen kann.
Metastase
Metastasen besteht aus einer mehrstufigen Kaskade von Ereignissen, die in zwei beliebige Stufen unterteilt werden kann. Im ersten Stadium müssen sich Tumorzellen von der primären Stelle lösen, in angrenzende Gewebe wandern und eindringen und dann in den Blutkreislauf intravasieren. Im zweiten Stadium müssen Tumorzellen im Kreislauf überleben, aus dem Blut oder den Lymphgefäßen extravasieren und schließlich an sekundären Stellen besiedeln23. Um zwischen diesen frühen und späten Ereignissen zu unterscheiden und das Potenzial/die Fähigkeit der verschiedenen Tumorzellen zu adressieren, diese Schritte durchzuführen, haben wir einen einfachen Assay entworfen.
Im Allgemeinen können Tumorzellen, wenn sie in das PVS injiziert werden, direkt in den Kreislauf eintreten und dann physisch im kaudalen hämatopoetischen Gewebe (CHT) (Schwanzbereich) gefangen werden. Jedoch, nach den Eigenschaften jeder Tumorzelle – wir haben gesehen, dass einige Tumorzellen am CHT 4 dpi bleiben und in der Lage sind, Mikrometastasen zu bilden, während andere Tumorzellen verschwinden (gelöscht, nachdem sie in der CHT gefangen wurden).
Daher können wir durch den Vergleich der Mikrometastaseneffizienz (bei 4 dpi), wenn Zellen direkt in den Kreislauf gebracht wurden – CIRC (Zellen müssen nur die späten Schritte der Metastasierung durchlaufen) vs. wenn nicht – NO CIRC (Zellen müssen frühe und späte Schritte durchlaufen, um eine Mikrometastasierung bilden zu können) ihr frühes oder spätes metastasiertes Potenzial bewerten. Wir haben Tumorzellen beobachtet, die in beiden Gruppen (CIRC und NO CIRC) effizient Mikrometastasen in der CHT bilden können, was darauf hindeutet, dass diese Zellen die Fähigkeit haben, alle Schritte der metastasierenden Kaskade (SW480 und MDA-MB-468 zum Beispiel)8,11zu durchlaufen. Im Gegensatz dazu haben andere Tumorzellen in beiden Gruppen ein sehr geringes metastasiertes Potenzial, das selbst bei injektionen Mikrometastasen kaum jemals mikrometastasiert (d.h. im CHT mit 24 PSi sichtbar ist, aber bei 4 dpi nicht mehr da ist, hs578T zum Beispiel)8. Wir haben jedoch eindeutig eine andere Gruppe gefunden – eine, die nur in der Lage ist, Mikrometastasen zu bilden, wenn sie in den Kreislauf injiziert wird (wir können nur Mikrometastasen in der CIRC-Gruppe beobachten). Dies deutet darauf hin, dass diese Zellen eine geringe Effizienz bei der Durchführung der ersten Schritte der metastasierenden Kaskade haben, aber auf der anderen Seite in der Lage sind, im Kreislauf zu überleben, zu extravasatisieren und eine entfernte Stelle zu kolonisieren.
Immunostaining und Imaging
Vor der Fixierung kann dieses Injektionsprotokoll für andere Live-Imaging-Ansätze wie Live Differential Interference Contrast (DIC)-Mikroskopie, Spinnscheibenmikroskopie, hochauflösende Konfokalbild-Live-Bildgebung und Lichtbogenmikroskopie usw. verwendet werden.
Tote Zellen und zelluläre Trümmer erscheinen hell, wenn sie durch das fluoreszierende Stereomikroskop beobachtet werden, und können mit lebenden Zellen verwechselt werden, insbesondere wenn das Ziel der Studie darin besteht, das metastasierende Potenzial der Zelllinien zu bewerten. Wir möchten betonen, wie wichtig es ist, konfokale Bildgebung mit spezifischen Lebensfähigkeitsmarkern und DAPI durchzuführen, um den Überlebenszustand des Tumors und der Mikrometastasen zu bewerten. Auch ist es von grundlegender Bedeutung, spezifische menschliche Antikörper zu verwenden, um menschliche Zellen wie antihumane Mitochondrien oder antihumane HLA zu erkennen. Trainieren Sie bei der Implementierung des Protokolls die Experimentatoraugen, indem Sie die Färbung im Stereomikroskop mit den konfokalen Bildern vergleichen. Nach einiger Zeit können Experimentatoren Trümmer deutlich von lebenden Zellen im fluoreszierenden Stereomikroskop unterscheiden.
Obwohl andere Methoden zur Quantifizierung der Tumorbelastung, wie z. B. der gesamten Fluoreszenzbereich, weit verbreitet sind, empfehlen wir, eine ganze Mount-Immunostainierung und konfokale Bildgebung als genauere Methode durchzuführen. Nicht nur die Effizienz der lipophilen Farbstofffärbung ist sehr variabel (d.h. einige Zellen sind sehr gut gefärbt, während andere nicht -wahrscheinlich aufgrund des Lipidgehalts ihrer Membranen sind), sondern auch oft lipophile Farbstoffe bilden Aggregate, und abgestorbene Zellen neigen dazu, heller zu sein – und mehrere Artefakte zu schaffen, die mit lebenden Zellen verwechselt werden können.
Zellen können mit fluoreszierenden Proteinen transduziert werden, um bei ihrer Verfolgung zu helfen und die Zellkennzeichnung zu überspringen. Stellen Sie jedoch sicher, dass die transduzierten und nicht transduzierten Zellen die gleichen Ergebnisse in den Zebrafisch-Xenografts produzieren.
Darüber hinaus können Makrophagen diese fluoreszierenden Zellablagerungen phagozyten und fluoreszierend beschriftet werden und migrieren, wodurch falsch positive metastasierende Zellen erzeugt werden. Daher empfehlen wir eine Reihe von Analysewerkzeugen, die natürlich auf viele andere Auslesungen ausgedehnt werden können, um das Tumorverhalten genauer zu interpretieren:
Für eine konfokale Erfassung mit einem Intervall von 5 m zwischen den Scheiben im Z-Stack der Kontrollkrebszellen HCT116 (durchschnittliche Kerngröße von 10-12 m Durchmesser) mit DAPI-Gegenfärbung haben wir beobachtet, dass 50 % der Zellen zwischen zwei aufeinanderfolgenden Scheiben aufgeteilt werden. Wenn also jedes Segment gezählt wird, besteht ein hohes Risiko, dass dieselben Zellen zweimal gezählt werden. Das Hin- und Hergehen zwischen Slices, um Probleme bei der Quantifizierung zu vermeiden, führt zu einer zeitaufwändigen und fehleranfälligen Technik. Um die Quantifizierung der Gesamtzahl der Zellen zu erleichtern und mehr Reproduzierbarkeit zwischen Forschern zu ermöglichen, haben wir die zuvor in diesem ProtokollbeschriebeneTumorgrößenformel erstellt 8 .
Wir haben eine Korrekturnummer (1.5) aufgenommen, um die 50 %-Zellen zu berücksichtigen, die zwischen Slices aufgeteilt werden. Wir fanden heraus, dass der durchschnittliche Fehler bei der manuellen Zählung des gesamten Tumors zwischen den Forschern 20% betrug. Zwei Forscher, die die Formel verwendet, hatten einen 2%-Fehler. Die Verwendung dieser Formel hat eine Genauigkeitsrate von 93 % und eine Reproduzierbarkeitsrate von 98 %. Wir haben auch automatisierte Methoden getestet, aber sie zeigten einen Fehler von mehr als 50 %, der durch Schwellenwerteinstellungen verursacht wurde.
Aufgrund der Eigenschaften apoptotischer Zellen ist die Quantifizierung aktivierter Caspase-3-Zellen schwieriger. Um die Anzahl der Fehler und Die Variation der Ergebnisse zu reduzieren, empfehlen wir, dass die Kontroll- und Versuchsproben vom selben Forscher gezählt werden. Darüber hinaus muss ein neuer Forscher beim Erlernen dieser Technik Bilder zählen, die bereits von erfahreneren Forschern quantifiziert wurden, um Ergebnisse zu vergleichen und zu trainieren.
Die Länge des Assays kann bei Bedarf verlängert werden. Es ist jedoch wichtig zu berücksichtigen, dass Zebrafischlarven ab 7 Tagen nach der Befruchtung (5 Tage nach der Injektion) eine lebende Fütterung benötigen. Darüber hinaus können die Tierschutzrichtlinien und -vorschriften für Larven, die älter als 6 Tage nach der Befruchtung sind, variieren.
Dieses Protokoll bietet nützliche Werkzeuge, die es einem einzelnen Forscher ermöglichen, etwa 200-300 Zebrafischlarven pro Stunde zu injizieren; und Ergebnisse für den vollständigen Assay, einschließlich Analyse und statistischer Interpretation, die in drei Wochen erzielt wurden. Wir hoffen, dass dieses Protokoll Forschern helfen kann, Experten bei der Erzeugung von Zebrafisch-Xenografts zu werden. Es ist nicht einfach; Sie müssen üben, aber Sie werden es erreichen. Viel Glück!
The authors have nothing to disclose.
Wir danken der Champalimaud Foundation, Congento (LISBOA-01-0145-FEDER-022170, kofinanziert von FCT/Lisboa2020) für die Finanzierung. FCT-Stipendien für VP (SFRH/BD/118252/2016), MML (PD/BD/138203/2018). Alle Mitglieder des Fior Lab für kritische Diskussionen; B. Costa und C. Rebelo de Almeida für den Datenaustausch; und unsere Lab-Mitglieder C. Rebelo de Almeida, M. Barroso und L. Leite für ihre Teilnahme an dem Video. Wir danken der CF Fish Facility (C. Certal, J. Monteiro et al.) und dem Team von Champalimaud Communication, Events and Outreach insbesondere Alexandre Azinheira für die fantastische Filmproduktion und Catarina Ramos und Teresa Fernandes für ihre Hilfe.
Agar for bacteriology | VWR | 97064-336 | Agar plate |
anti-Caspase3Asp175 (Rabbit monoclonal) | Cell Signalling Technologies | 9661 | Primary antibody for whole mount immuno staining (Dilution 1:100) |
anti-human HLA (Rabbit monoclonal) | Abcam EP1395Y | ab52922 | Primary antibody for whole mount immuno staining (Dilution 1:100) |
anti- 488 (Rabbit monoclonal) | ThermoFisher Scientific | 35552 | Secondary antibody for whole mount immuno staining (Dilution 1:200) |
anti- 594 (Rabbit monoclonal) | ThermoFisher Scientific | 35560 | Secondary antibody for whole mount immuno staining (Dilution 1:200) |
CellTracker Deep Red Dye | ThermoFisher Scientific | C34565 | Lipophilic dye (Dilution 1:1000) |
CellTracker Green CMFDA Dye | ThermoFisher Scientific | C2925 | Lipophilic dye (Dilution 1:1000) |
Conical Centrifuge tube 50mL | VWR | 525-0610 | |
Conical Centrifuge tube 15mL | VWR | 525-0604 | |
DAPI | Nuclear and chromosome counterstain | ||
Laser-Based Micropipette Puller P-2000 | Sutter-Instrument | Micropipette Puller | |
Microcentrifuge tube 1.5mL | Abdos | P10202 | |
Microscope slides, cut edge | RS France | BPB016 | Slides for mounting |
Mowiol | Sigma-Aldrich | 81381 | Mounting medium |
Pneumatic Picopump | World Precision Instruments | PV820 | Microinjector |
Rectangular cover glasses, Menzel Gläser | ThermoFisher Scientific | 631-9430 | Coverslips for mounting |
SeaKem LE Agarose | Lonza | 50004 | Agar plate |
Thin Wall Glass Capillaries | World Precision Instruments | TW100-4 | Borosilicate capillaries |
TrypLE | Gibco | 12605036 | Enzymatic detachment solution |
Vaseline | Petroleum jelly for slide sealing | ||
Vybrant CM-DiI Dye | ThermoFisher Scientific | V22888 | Lipophilic dye (Dilution 1:1000) |
Vybrant DiO Cell-Labeling Solution | ThermoFisher Scientific | V22886 | Lipophilic dye (Dilution 1:1000) |
ZEISS Axio Zoom.V16 for Biology | ZEISS | Fluorescence Stereo Zoom Microscope | |
Zeiss LSM 710 | ZEISS | Confocal microscope |