Ett medborgarforskningsprojekt utformades för att rekrytera San Diego-invånare för att samla in miljöprover för SARS-CoV-2. En flerspråkig webbaserad plattform skapades för dataöverföring med hjälp av ett användarvänligt gränssnitt för mobila enheter. Ett laboratorieinformationshanteringssystem underlättade insamlingen av tusentals geografiskt olika prover med resultatspårning i realtid.
För att kontrollera samhällsöverföringen av allvarliga akuta respiratoriska syndrom coronavirus 2 (SARS-CoV-2) under den globala pandemin 2020 implementerade de flesta länder strategier baserade på direkt mänsklig testning, ansiktsskydd och ytdesinfektion. Under antagandet att huvudvägen för överföring omfattar aerosoler och luftvägsdroppar har insatserna för att upptäcka SARS-CoV-2 hos fomiter fokuserat på platser som misstänks vara av hög prevalens (t.ex. sjukhusavdelningar, kryssningsfartyg och masstransportsystem). För att undersöka förekomsten av SARS-CoV-2 på ytor i stadsmiljön som sällan rengörs och sällan desinficeras, värvades 350 medborgare från san diego county. Totalt samlade dessa medborgarforskare in 4 080 prover. En onlineplattform utvecklades för att övervaka leverans och upphämtning av provtagningskit samt för att samla in exempeldata. Provtagningssatserna byggdes mestadels av förnödenheter som fanns i pandemistressade butiker. Prover bearbetades med reagenser som var lätta att komma åt trots den återkommande försörjningsbristen. De metoder som användes var mycket känsliga och resistenta mot hämmare som ofta förekommer i miljöprover. De föreslagna experimentella design- och bearbetningsmetoderna lyckades engagera många medborgarforskare som effektivt samlade prover från olika ytor. Arbetsflödet och metoderna som beskrivs här är relevanta för att kartlägga stadsmiljön för andra virus, som är av folkhälsoproblem och utgör ett hot mot framtida pandemier.
SARS-CoV-2 tros huvudsakligen överföras via inandning av förorenade aerosoler och droppar från direktkontakt med infekterade individer1,2,3,4. Under de inledande faserna av den globala COVID-19-pandemin fokuserade dock insatserna för att kontrollera överföringen av SARS-CoV-2 starkt på desinfektion av ytor, handtvätt och sanering. I slutet av 2020 bedömde överföringsriktlinjer från Världshälsoorganisationen (WHO)5 och U.S. Centers for Disease Control and Prevention (CDC)6 luftburen överföring som en fara främst vid nära kontakt (<2 m) med en smittad person eller i närvaro av aerosolgenererande medicinska procedurer. Självinokulering efter kontakt med förorenade ytor eller inandning av aerosoliserade fomites har ännu inte uteslutits som en överföringsväg av SARS-CoV-2.
Covid-19-fall har rapporterats där luftburen överföring verkar osannolik7,8. SARS-CoV-2 virions förblir smittsamma på koppar i upp till 8 h, på kartong och rostfritt stål i upp till 24 h och på plast i upp till 48 h9. I kryssningsfartygshytter upptäcktes SARS-CoV-2 RNA 17 dagar efter att passagerarna hade avgått7. Luft- och ytprover från sjukhus och masstransiteringssystem har testats positivt för SARS-CoV-2 och andra coronavirus8,10,11,12,13,14. En studie utförd på ytterförpackningen av Halloween godis hanteras av asymtomatiska och måttliga /milt symptomatiskt COVID-19 patienter, drog slutsatsen att kombinationen av handtvätt av hanteraren och tvättning av godis med hand tvål minskade SARS-CoV-2 RNA till under tröskelvärde nivåer15.
Flera metoder för SARS-CoV-2 diagnostik har publicerats baserat på realtid omvänd transkription polymeras kedjereaktion (RT-qPCR)16,17,omvänd transkription loop-medierad isotermisk förstärkning (RT-LAMP)11,18,19,20,21och CRISPR-Casteknik 18,19,22,23. De flesta kräver RNA-extraktionssatser som ofta är en bristvara under perioder med betydande global efterfrågan, och mycket få har använts för miljöscreening av viruset24. Detektion av SARS-CoV-2 RNA med RT-LAMP har visat sig vara över 83% konkordans till att använda RT-qPCR. Dessutom resulterade RT-LAMP i en minskning av de ofullständiga resultaten med 25 % jämfört med RT-qPCR15.
RT-LAMP är en enkel teknik som använder en omvänd transkription för att syntetisera cDNA från en RNA-mall25, följt av en DNA-polymeras med stark strandförskjutningsaktivitet som syntetiserar DNA vid konstant temperatur (dvs isotermisk förstärkning)26. Högre specificitet av viral genomdetektering uppnås med hjälp av fyra eller sex primers som känner igen sex eller åtta regioner av mål-DNA. Förstärkning initieras från en intern primer och ger en halvdubbelsträngad DNA-struktur. Den ledande strängen förstärks sedan av en yttre primer. Dessa förstärkningar upprepas för de omvända primersna. Interna och yttre primers i vardera änden har en intern omvänd självkomplingande plats som bildar en slinga i förstärkningsprodukten26,27. Vid isotermisk strängförskjutning genererar asynkron DNA-syntes stora mängder förstärkt produkt där kontinuerlig polymerisation förstärker signalen på så få som 10 kopior per reaktion11,20,28. Den kolorimetriska RT-LAMP-blandningen är svagt buffrad och använder fenolrött som pH-indikator. Eftersom polymeraset innehåller en nukleotid frigör den en proton, och tillräckligt med protoner kommer att ändra lösningens pH samt dess färg från rosa till gul11,20,28,29.
RT-LAMP utvecklades för påvisande av myggburna sjukdomar i perifera vårdinrättningar som saknar fullt utrustadelaboratorier 25 och för snabb upptäckt av andra RNA-virus som humant immunbristvirus30. De mest utsatta befolkningsgrupperna i epidemiutbrott – enligt WHO:s definition – saknar ofta tillräckliga ekonomiska resurser och lämplig utrustning för att utföra upptäckt (FN:s globala folkhälsoagenda). I den nuvarande SARS-CoV-2-pandemin har leveranser som svabbprover av medicinsk kvalitet och reagenser för RNA-extraktionssatser inte kunnat möta den globala efterfrågan, särskilt i icke-tillverkningsländer. Det föreslagna protokollet använde en guanidinium tiocyanate (GITC)-baserade rå RNA extraktion, som effektivt bevarade RNA på ett kallt-kedja oberoende sätt och avsevärt minskade persistensen av inhibitorer från provet. Dessutom är GITC-kloroform extraktionsprotokollet baserat på separationen av RNA från DNA och proteiner följt av respektive nederbörd, vilket möjliggör återvinning av det mesta av det genetiska materialet. Dessa fördelar överväger de potentiella farorna för medborgarforskare som hanterar kemikalien om åtgärder vidtas för att på lämpligt sätt informera dem om riskerna.
Det föreslagna arbetsflödet använder material och reagenser som är av allmän användning. Det kräver utrustning som finns i grundläggande, ofta lantliga, laboratoriemiljöer. Dessa metoder är billiga, mycket resistenta mot hämmare som ofta finns i miljöprover eller prover som inte kan bearbetas med extraktionssatser och eliminerar behovet av en högprecisions termocyklist. Denna studie presenterar en pipeline för provtagning och detektion av SARS-CoV-2 från miljöreservoarer vid gemensamt vidrörda och sällan desinficerade ytor hos hushåll och stadsmiljön.
Medborgarforskarengagemang. Medborgarforskare rekryterades för att svabba ytor i hela San Diego County för att ta prover och upptäcka närvaron av SARS-CoV-2 i stadsmiljön. Majoriteten av de levererade provtagningssatserna (70 %) återlämnades till laboratoriet, och av dessa var nästan alla prover fullständiga (91 %) (Figur 3A,B och tabell 4). Volontärer kan enkelt begära leverans/ upphämtning av kit via den webbaserade plattformen, och programvaran för leveransvägsplanering meddelade medborgarforskare om uppskattade ankomsttider, båda sannolikt signifikanta faktorer för den observerade framgången. Den genomsnittliga tiden från det att satsen levererades till medborgarforskaren till när den återlämnades till laboratoriet var 8 dagar, med en median på 3 dagar och ett intervall på 1-64 dagar (figur 3A och tabell 4). Mer frekventa påminnelser till volontärer skulle sannolikt minska denna fördröjningstid.
Datainsamlingsplattformen användes framgångsrikt av en stor majoritet av användarna (73%) (Tabell 4). Även om medborgarforskarnas ansträngningar inte mättes, visade fälttester att datainsamlingsplattformen avsevärt minskade den ansträngning och tid som krävdes för att korrekt slutföra provinsamlingen. Att minska mängden bokföring uppmuntrade således medborgarforskarengagemang. Den webbaserade plattformen syftade till att övervinna demografiska begränsningar genom att tillhandahålla en flerspråkig neural maskinöversättningstjänst och genom att tillhandahålla grafiska och audiovisuella protokoll på engelska och spanska. Detta var endast delvis framgångsrikt eftersom färre prover samlades in från både South Bay och North County där större delen av länets latinamerikanska / latinobefolkning bor45. Dessa områden hyste också 63% (1 700 fall per 100 000) av de totala COVID-19-fallen i San Diego County med den högsta prevalensenav sjukdomen 46 och antalet sjukhusvistelse (62%)47,48. Även om de flesta av proverna kom från Central County, samlades ett representativt antal in från de mest COVID-19-drabbade distrikten och endast en liten del av proverna var positiva, vilket tyder på att ytreservoarer av SARS-CoV-2 i stadsmiljön är relativt sällsynta.
Provbehandling. Provtagningssvabbar var våta med SDS, som inaktiverade viruset genom att störa dess kuvert och stabiliserade det nakna RNA genom att veckla ut RNases32. Bekvämt under uppsamlingen rengjorde tvättmedlet i svabbprovet den provsatta ytan. Miljöprover innehåller ofta mycket små mängder RNA. För att maximera återhämtningen utfördes RNA-isolering med hjälp av en GITC-baserad, kolumnfri, råextraktionsmetod. GITC, ett starkt chaotropt medel, stör vätebindningarna som upprätthåller proteinveckning (dvs. hydrofobisk effekt). Denna åtgärd resulterar i inaktivering av viruspartiklar, och RNA förblir stabil på grund av hämningen av RNAses34,35,36. GITC-lösningen behöll stabiliteten hos RNA-proverna utan strikta överväganden i kylkedjan, vilket gjorde det möjligt för medborgarna att behålla proverna vid rumstemperatur om en frys för de medföljande isförpackningarna inte fanns tillgänglig. För att minska den potentiella fara som detta reagens utgör när direkt hud- eller slemhinnakontakt uppstår, blev medborgarna medvetna om dessa risker genom att inkludera ett materialsäkerhetsdatablad som finns i satsen och en varningstätning placerades i lådan som innehåller rören.
Den råa GITC-kloroform extraktionsmetoden hjälpte återvinning av spår av RNA från svabbproverna, och som framgår av förstärkningen av spikade prover, hämmare kvarstod sällan i proverna efter extraktion. Prover, som var negativa för SARS-CoV-2 och visade ingen RT-LAMP hämning, representerade verkliga negativa eller hade ett lägre kopieringsnummer än LOD vid 100% frekvens. Omvänt innebär detektion av viralt RNA på en yta inte direkt risk för överföring genom kontakt eftersom virusets smittsamhet från positiva prover måste testas. En snabb miljökontroll, som inte begränsas av tillgången till sofistikerade förnödenheter eller högkvalificerad personal, är avgörande för att bedöma om ytor utgör en virusreservoar och för bättre direkta förebyggande och inneslutningsinsatser.
RT-LAMP valdes ut som den bästa metoden som lämpar sig för den föreslagna detektionsledningen. Det visade sig vara en snabb och billig metod som var mycket resistent mot de flesta av de återstående hämmarna och lika känslig och specifik som andra RT-qPCR-metoder. På grund av deras användning i kliniska inställningar under SARS-CoV-2-pandemin påverkades tillgängligheten av RT-qPCR-kit av global efterfrågan. Dessutom var RT-qPCR-tekniker – även de som formulerades för att motstå hämmare – känsliga för ämnen som ingår i de miljöprover som samlats in av en pilotkohort av medborgarforskare, även efter användning av andra gemensamma strategier för att minska hämmarkonkurrensen förenzymbindning 49. Dessa resultat bekräftas av en ny studie som jämförde båda metoderna för att upptäcka SARS-CoV-2 på svabbprover från godis hanteras av COVID-19 patienter och fann över 83% resultatöverensstämmelse, med 25% lägre hämning i prover analyseras av RT-LAMP15. Dessutom minskade GITC-kloroform råextraktion, tillsammans med RT-LAMP, kostnaden för reagenser och leveranser med 42% jämfört med RNA-kitextraktion och RT-qPCR (Materialförteckning).
Denna metod möjlige analys av hög genomströmning av tusentals ytsvabbprover. Upp till 80 pooler, som representerar 640 prover, bearbetades på 2 dagar från RNA-extraktion till SARS-CoV-2-detektion av RT-LAMP. Det föreslagna protokollet är semiquantitative, begränsat till detektion av viralt RNA, och indikerar inte förekomsten av smittsamma viruspartiklar. Ytterligare analys krävs för att bedöma risken för överföring av SARS-CoV-2 från infekterade fomites som finns på de swabbed ytorna.
Den här studien presenterar ett protokoll för att snabbt skapa en teststrategi som innehåller ett effektivt arbetsflöde när du står inför en hälsokris med en smittsam sjukdom. Det föreslagna provtagningsprotokollet är enkelt och använder förnödenheter som ofta finns i hushållen, och metoden för viral detektion utförs på utrustning som finns tillgänglig i grundläggande laboratoriemiljöer, t.ex. Kostnaderna för RT-LAMP-reagenser är betydligt lägre än de som behövs för RT-qPCR och mindre mottagliga för scenarier med hög global efterfrågan. Denna studie fungerar som ett ramverk för bedömning av miljövirusreservoarer i framtida epidemiutbrott och globala pandemier.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Viral Information Institute (VII) utredare, Dr. Anca M. Segall, Willow Segall, Patricia L. Rohwer, Gary Rohwer, Cary L. Rohwer, Magda Silvia Pinetta, Elizabeth Cruz Cano, Dr Gregory Peters, Dr. Stuart A. Sandin och Dr. Jennifer Smith för att ta sig tid att samla in många prover. Vi tackar också Dr. Rob Knight, Dr. Jack Gilbert, Dr. Pedro Balda-Ferre och Dr. Sarah Allard från institutionen för pediatrik vid School of Medicine University of San Diego California (UCSD) för att underlätta positiva kontroller och användbar feedback. Vi tackar Stacey Carota (SDSU College of Sciences) och Gina Spidel (SDSU) för logistiskt stöd och Juan Rodríguez för konsten och den grafiska utformningen av provtagningsprotokollet. Vi tackar alla deltagare för deras engagemang och engagemang för detta projekt under mycket svåra tider. Detta arbete stöddes av en generös donation från Dr. Jo Ann Lane (SDSU College of Sciences) och National Science Foundation RAPID: Environmental Reservoirs of SARS-CoV-2 grant (Award Number: 2030479).
SMP, LIMS, and community outreach: | |||
Authentication Application Programming Interface | Google Sign-In | ||
Commercial hosting platform | GoDaddy | ||
Data Charting Application Programming Interface | Google Charts | ||
Database software | MySQL | ||
Delivery route planning software | Circuit | Circuit for Teams | |
Free email service | Google Email | ||
Geospatial Application Programming Interface | Google Maps API | ||
Multilingual neural machine translation service | Google Translate | ||
Online form | Google Form | ||
Operating system | Linux | ||
Web and database development | Big Rose Web Design | ||
Web server software | Apache | ||
Sampling kit: | |||
Coolers | Coleman (Amazon) | B00363X3F2 | Cost (US$) per 100 rxns: 70 |
Gallon Ziploc bags | Solimo (Amazon) | B07BJ495GL | Cost (US$) per 100 rxns: 18 |
Glycerol (hand sanitizer) | FischerScientific | G33-4 | Cost (US$) per 100 rxns: 9 |
Ice packs | Ice-Brix (Amazon) | B075GLD3X1 | Cost (US$) per 100 rxns: 110 |
Isopropanol (hand sanitizer) | FischerScientific | AA36644K7 | Cost (US$) per 100 rxns: 43 |
KN95 masks | Echo-Sigma | Echo-Sigma | Cost (US$) per 100 rxns: 400 |
Paper for Protocols and Trizol Safety Sheet | Office Depot | 348037 | Cost (US$) per 100 rxns: 36 |
30 mL spray bottles (SDS and hand sanitizer) | Anyumocz (Amazon) | B07T64FHXR | Cost (US$) per 100 rxns: 80 |
RNase, DNase, DNA & PCR inhibitors free Microcentrifuge tubes | Genesee Scientific | 22-281 | Cost (US$) per 100 rxns: 83 |
Sample ID solvent resistant labels | LABTAG | XST-10C1-1WH | Cost (US$) per 100 rxns: 68 |
Swiffer WetJet pads (swabs) | Swiffer (Amazon) | B001F0RBT2 | Cost (US$) per 100 rxns: 8 |
Toothpicks | Kitchen Essential (Amazon) | B00PBK4NG6 | Cost (US$) per 100 rxns: 8 |
Trizol Reagent (guanidinium isothiocyanate solution – GITC), not LS | Invitrogen | 15596018 | Cost (US$) per 100 rxns: 40 |
Tube boxes | Genesee Scientific | 21-119 | Cost (US$) per 100 rxns: 180 |
Small Ziploc bags | Ziploc (Amazon) | B01LRKEI9K | Cost (US$) per 100 rxns: 8 |
Zebra Thermal Transfer Desktop Printer | Zebra | GK420t | |
Total Sampling kit Cost (US$) per 100 rxns: 1,160 | |||
Trizol RNA extraction: | |||
Ammonium Acetate RNase-free | Invitrogen | AM9070G | Cost (US$) per 100 rxns: 2 |
Chloroform | FisherScientific | C298-500 | Cost (US$) per 100 rxns: 2 |
GlycoBlue (glycogen 15 mg/mL) | Invitrogen | AM9515 | Cost (US$) per 100 rxns: 80 |
Molecular-grade absolute (200 proof) Ethanol | FisherScientific | BP2818500 | Cost (US$) per 100 rxns: 30 |
Molecular-grade Isopropanol | FisherScientific | BP2618500 | Cost (US$) per 100 rxns: 3 |
TURBO DNA-free Kit | Invitrogen | AM1907 | Cost (US$) per 100 rxns: 110 |
Multiplexed colorimetric RT-LAMP: | |||
Guanidine Hydrochloride | Alfa Aesar | AAJ6548522 | Cost (US$) per 100 rxns: 1 |
RT-LAMP E1-Primers | IDT | n/a | Cost (US$) per 100 rxns: 7 |
RT-LAMP N2-Primers | IDT | n/a | Cost (US$) per 100 rxns: 7 |
Synthetic SARS-CoV-2 RNA | ATCC | VR-3276SD | Cost (US$) per 100 rxns: 14 |
WarmStart Colorimetric LAMP 2X Master Mix with UDG | NEB | M1800S | Cost (US$) per 100 rxns: 210 |
Eppendorf Mastercycler Pro Thermal Cycler | Eppendorf | 950030010 | |
Total Trizol RNA extraction + LAMP Cost (US$) per 100 rxns: 470 | |||
Kit for RNA extraction: | |||
QIAamp DSP Viral RNA Mini Kit | Qiagen | 61904 | Cost (US$) per 100 rxns: 570 |
RT-qPCR: | |||
Synthetic SARS-CoV-2 RNA | ATCC | VR-3276SD | Cost (US$) per 100 rxns: 14 |
TaqMan Fast Virus 1-Step Master Mix | Applied Biosystems | 4444432 | Cost (US$) per 100 rxns: 180 |
SARS-CoV-2 (2019-nCoV) N1,N2 Primers and Probes | IDT | 10006713 | Cost (US$) per 100 rxns: 20 |
qScript XLT 1-Step RT-qPCR ToughMix | Quantabio | 95132-100 | |
QuantiNova Pathogen | Qiagen | 208652 | |
QuantiNova Probe | Qiagen | 208352 | |
UltraPlex 1-Step ToughMix | Quantabio | 95166-100 | |
CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System | BioRad | 1855196 | |
Kit for RNA extraction + RT-qPCR Cost (US$) per 100 rxns: 790 | |||
RT-PCR: | |||
SuperScript IV One-Step RT-PCR | Invitrogen | 12594025 | |
Lab cleanup: | |||
DNAZap | Invitrogen | AM9890 | |
RNAZap | Invitrogen | AM9780 |