시민 과학 프로젝트는 SARS-CoV-2에 대한 환경 샘플을 수집하기 위해 샌디에고 주민을 모집하도록 설계되었습니다. 다국어 웹 기반 플랫폼은 사용자 친화적인 모바일 장치 인터페이스를 사용하여 데이터 제출을 위해 만들어졌습니다. 실험실 정보 관리 시스템은 실시간 결과 추적을 통해 지리적으로 다양한 수천 개의 샘플을 수집할 수 있도록 했습니다.
2020년 글로벌 전염병 중 중 심각한 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2(SARS-CoV-2)의 지역 사회 전염을 제어하기 위해 대부분의 국가는 직접적인 인간 검사, 얼굴 덮개 및 표면 소독에 기반한 전략을 구현했습니다. 전송의 주요 경로는 에어로졸과 호흡 물방울을 포함한다는 가정하에, fomites에서 SARS-CoV-2를 검출하는 노력은 높은 보급의 의심 되는 위치 (예를 들어, 병원 병동, 유람선, 및 대량 운송 시스템)에 초점을 맞추고있다. 거의 청소되지 않는 도시 환경의 표면에 SARS-CoV-2의 존재를 조사하기 위해, 350 시민은 더 큰 샌디에고 카운티에서 입대했다. 이 시민 과학자들은 총 4,080개의 샘플을 수집했습니다. 샘플링 키트 배달 및 픽업을 모니터링하고 샘플 데이터를 수집하기 위해 온라인 플랫폼이 개발되었습니다. 샘플링 키트는 대부분 전염병 스트레스 매장에서 사용할 수 있는 소모품으로 제작되었습니다. 시료는 재발공급 부족에도 불구하고 쉽게 접근할 수 있는 시약을 사용하여 처리되었습니다. 사용된 방법은 환경 견본에 일반적으로 존재하는 억제제에 높게 민감하고 저항했습니다. 제안된 실험 설계 및 처리 방법은 다양한 표면 영역에서 샘플을 효과적으로 수집한 수많은 시민 과학자들을 참여시키는 데 성공했습니다. 여기에 설명된 워크플로우와 방법은 공중 보건에 관한 것이고 미래의 전염병에 위협이 되는 다른 바이러스에 대한 도시 환경을 조사하는 데 관련이 있습니다.
SARS-CoV-2는 감염된개인1,2,3,4와직접 접촉하여 오염된 에어로졸및 물방울의 흡입을 통해 주로 전염되는 것으로 생각된다. 그러나, 글로벌 COVID-19 전염병의 초기 단계에서 SARS-CoV-2의 전송을 통제하기 위한 노력은 표면 소독, 손씻기 및 살균에 강하게 집중했습니다. 2020년 말까지 세계보건기구(WHO)5와 미국 질병통제예방센터(CDC)의 전송 지침은 감염된 사람과 가까운 접촉(<2m)에 있거나 에어로졸 생성 의료 절차가 있을 때 주로 공중 전염위험이 있다고 판단했습니다. 오염된 표면과의 접촉 또는 에어로졸화 된 포미트의 흡입 과 접촉 한 후 자가 접종은 SARS-CoV-2의 전송 경로로 아직 배제되지 않았습니다.
COVID-19 케이스는 공중 전송이 가능성이 보인다보고되었습니다 7,8. SARS-CoV-2 virions는 최대 8시간 동안 구리, 골판지 및 스테인리스 스틸에서 최대 24시간 동안, 최대 48h9의플라스틱에 전염성을 유지합니다. 유람선 선빈에서 SARS-CoV-2 RNA는 승객이7번출발한 지 17일 후에 검출되었습니다. 병원 및 대중 교통 시스템에서 공기 및 표면 샘플SARS-CoV-2 및 기타 코로나바이러스8,10, 11,12,13,14에대해 양성 반응을 보이고 있다. 무증상 및 중등/경미한 증상 COVID-19 환자에 의해 처리된 할로윈 사탕의 외부 포장에 수행된 연구는 손잡이에 의한 손 세척과 손비누로 사탕을 세척하는 조합으로 SARS-CoV-2 RNA를 임계값 수준15이하로 감소시키는 것으로 결론을 내렸다.
SARS-CoV-2 진단에 대한 여러 가지 방법은 실시간 역전사 폴리머라제 연쇄 반응(RT-qPCR)16,17,역전사 루프 매개 이소성 증폭(RT-LAMP)11,18,19,20,21, 및 CRISPR-Cas 기술 18, 19, 19, 20, 21, 및 CRISPR-Cas 기술18, 19,19, 19, 20, 21 및 CRISPR-Cas 기술 18, 19, 19, 20, 21 및 CRISPR-Cas 기술 18,19, 19, 19,20, 21, 및 CRISPR-Cas 기술18, 19, 19,20,21,및 CRISPR-Cas 기술 18, 19,293을기반으로 발표되었습니다. 대부분은 상당한 글로벌 수요기간 동안 공급이 부족한 RNA 추출 키트를 필요로 하며,바이러스(24)의환경 검진에는 거의 사용되지 않았다. RT-LAMP를 사용하여 SARS-CoV-2 RNA의 검출은 RT-qPCR을 사용하는 데 83% 이상의 일치하는 것으로 입증되었습니다. 또한 RT-LAMP는 RT-qPCR 15에 비해 결정적인 결과를25%감소시켰습니다.
RT-LAMP는 RNA템플릿(25)으로부터cDNA를 합성하기 위해 역실을 사용하는 간단한 기술이며, 이어서 일정한 온도(즉, 이더스피증폭)에서DNA를 합성하는 강한 가닥 변위 활성을 가진 DNA 중합체를 이룬다. 바이러스 게놈 검출의 높은 특이성은 표적 DNA의 6 개 또는 8개의 지구를 인식하는 4개 또는 6개의 프라이머를 사용하여 달성됩니다. 증폭은 내부 프라이머에서 시작되고 반 이중 가닥 DNA 구조를 산출합니다. 선행 가닥은 바깥 쪽 프라이머에 의해 증폭됩니다. 이러한 증폭은 역 프라이머에 대해 반복됩니다. 양쪽 끝에 내부 및 외부 프라이머는 증폭제품(26)및27에서루프를 형성하는 내부 역방향 자체 보완 부위를 가지고 있다. 비등형 가닥 변위에서 비동기 DNA 합성은 연속 중합이 반응 당 10부로 적은 신호를 증폭하는 증폭된 제품의다량(11,20,28)을생성한다. 색수정 RT-LAMP 믹스는 약하게 버퍼링되고 페놀 레드를 pH 표시기로 사용합니다. 중합체는 뉴클레오티드를 통합함에 따라 양성자를 방출하고, 충분한 양성자는 용액의 pH뿐만 아니라 분홍색에서 노란색11,20,28,29로색상을 변경합니다.
RT-LAMP는 완전히 갖춰진실험실(25)이 부족한 주변 의료 시설에서 모기 매개 질병의 검출을 위해 개발되었으며, 인간 면역결핍바이러스(30)와같은 다른 RNA 바이러스의 신속한 검출을 위해 개발되었다. WHO 정의에 따라 전염병 발병에서 가장 취약한 인구는 종종 충분한 경제적 자원과 탐지를 수행하기위한 적절한 장비가 부족합니다 (유엔 글로벌 공중 보건 의제). 현재 SARS-CoV-2 전염병에서는 RNA 추출 키트에 대한 의료급 면봉 및 시약과 같은 공급이 특히 비제조 국가에서 는 글로벌 수요를 충족할 수 없었습니다. 제안된 프로토콜은 구안디늄 틸오카네이트(GITC)기반의 원유 RNA 추출을 사용하여, 이는 효과적으로 콜드 체인 독립적 인 방식으로 RNA를 보존하고 샘플에서 억제제의 지속성을 현저히 감소시키는. 더욱이, GITC-클로로폼 추출 프로토콜은 DNA와 단백질로부터의 RNA 분리를 기반으로 하며, 그 다음에는 각각의 강수량이 뒤따르며, 대부분의 유전 물질을 회수할 수 있다. 이러한 장점은 위험을 적절하게 알리기 위한 조치를 취하면 화학 물질을 취급하는 시민 과학자의 잠재적 위험보다 큽니다.
제안된 워크플로우는 일반적인 용도의 재료 및 시약을 사용합니다. 그것은 기본, 종종 시골, 실험실 설정에서 사용할 수있는 장비가 필요합니다. 이러한 방법은 추출 키트로 처리할 수 없는 환경 샘플이나 샘플에서 발견되는 억제제에 대한 고도로 저항력이 뛰어나며 고정밀 열순환기의 필요성을 제거합니다. 이 연구는 가정과 도시 환경의 일반적으로 만지고 드물게 감염된 표면에 환경 저수지에서 SARS-CoV-2의 샘플링 및 검출을위한 파이프 라인을 제시한다.
시민 과학자 참여. 시민 과학자들은 도시 환경에서 SARS-CoV-2의 존재를 샘플링하고 감지하기 위해 샌디에고 카운티 전역의 면봉 표면에 모집되었습니다. 배달된 샘플링 키트의 대부분(70%) 실험실로 반환되었고, 그 중 거의 모든 샘플이 완료되었습니다 (91%) (그림3A,B 및 표 4). 자원 봉사자는 웹 기반 플랫폼을 통해 키트 배달 / 픽업을 쉽게 요청할 수 있으며 배달 경로 계획 소프트웨어는 시민 과학자들에게 예상 도착 시간을 통보했으며, 관찰 된 성공에 중요한 요소가 될 수 있습니다. 키트가 시민 과학자에게 전달되었을 때실험실로 반환된 시점까지의 평균 시간은 8일, 중앙값은 3일, 1-64일(그림 3A 및 표 4)이었다. 자원봉사자들에게 더 자주 알림이 더 자주 주어질수록 이 지연 시간이 단축될 수 있습니다.
데이터 수집 플랫폼은 대다수의 사용자(73%)가 성공적으로 사용했습니다. (표4). 시민 과학자들의 노력은 측정되지 않았지만, 현장 테스트결과 데이터 수집 플랫폼은 샘플 수집을 제대로 완료하는 데 필요한 노력과 시간을 크게 줄였습니다. 따라서, 부기의 양을 줄이는 것은 시민 과학자참여를 장려했다. 웹 기반 플랫폼은 다국어 신경 기계 번역 서비스를 제공하고 영어와 스페인어로 그래픽 및 시청각 프로토콜을 제공함으로써 인구 통계학적 한계를 극복하기 위한 것입니다. 이것은 카운티의 히스패닉 / 라틴계 인구의 대부분이거주하는사우스 베이와 노스 카운티 모두에서 수집 된 샘플수가 적기 때문에 부분적으로만 성공했습니다. 이 지역은 또한 샌디에고 카운티에서 총 COVID-19 케이스의 63%(100,000명 당 1,700례)를 수용했으며, 질병46의 가장 높은 보급률과 입원률(62%)47,48. 대부분의 샘플은 센트럴 카운티에서 나왔지만, 가장 COVID-19에 영향을 받은 지역에서 대표적인 숫자를 수집했으며 샘플의 극히 일부만 양성으로 도시 환경에서 SARS-CoV-2의 표면 저수지가 상대적으로 드물다는 것을 시사합니다.
샘플 처리. 샘플링 면봉은 SDS로 젖어 봉투를 방해하여 바이러스를 활성화하고 RNases32를전개하여 알몸 RNA를 안정화시켰습니다. 수거 중 편리하게 면봉의 세제는 샘플링된 표면을 세척했습니다. 환경 샘플은 종종 매우 소량의 RNA를 함유하고 있습니다. 회복을 극대화하기 위해, RNA 절연은 GITC 기반, 컬럼 프리, 조잡한 추출 방법을 사용하여 수행되었다. GITC, 강한 chaotropic 에이전트, 단백질 접이식 유지 하는 수소 결합을 방해 (즉, 소수 성 효과). 이러한 작용은 바이러스 성 입자의 불활성화를 초래하고, RNA는RNA(34),35,36의억제로 인해 안정적으로 유지된다. GITC 용액은 엄격한 콜드 체인 고려 없이 RNA 샘플의 안정성을 유지하여 제공된 얼음 팩용 냉동고를 사용할 수 없는 경우 시민들이 실온에서 시료를 유지할 수 있도록 했습니다. 직접적인 피부 나 점막 접촉이 발생할 때 이 시약이 발생할 때 이러한 위험 위험을 줄이기 위해 시민들은 키트에 제공된 재료 안전 데이터 시트를 포함시킴으로써 이러한 위험을 인식하고 튜브를 포함하는 상자에 경고 씰을 배치했습니다.
조잡한 GITC-클로로폼 추출 방법은 면봉에서 RNA의 흔적의 회복을 도왔으며, 스파이크 샘플의 증폭에 의해 도시된 바와 같이, 억제제는 추출 후 샘플에서 거의 지속되지 않습니다. SARS-CoV-2에 대해 부정적이고 RT-LAMP 억제가 나타나지 않은 샘플은 진정한 네거티브를 나타내거나 100% 주파수에서 LOD보다 낮은 복사 번호를 가졌다. 반대로, 표면에서 바이러스 RNA의 검출은 양성 샘플에서 바이러스의 감염성을 테스트해야 하기 때문에 접촉을 통한 전염위험을 직접적으로 의미하지는 않는다. 정교한 공급품또는 고도의 자격을 갖춘 인력의 가용성에 의해 제한되지 않는 환경의 신속한 선별은 표면이 바이러스 성 저수지를 구성하는지 여부를 평가하고 보다 직접적인 예방 및 봉쇄 노력을 하는 데 매우 중요합니다.
RT-LAMP는 제안된 검출 파이프라인에 적합한 최상의 방법으로 선택되었다. 그것은 나머지 억제제의 대부분에 매우 저항 하고 다른 RT-qPCR 방법으로 민감 하 고 특정 신속 하 고 저렴 한 방법 입증. SARS-CoV-2 전염병 동안 임상 설정에서 사용했기 때문에 RT-qPCR 키트의 가용성은 글로벌 수요에 의해 영향을 받았습니다. 더욱이, RT-qPCR 기술은 억제제에 저항하기 위하여 공식화된 그조차 – 효소 결합에 대한 억제제 경쟁을 감소시키기 위하여 그밖 일반적인 전략의 사용 후에도 시민 과학자의 파일럿 코호트에 의해 집합된 환경 견본에 포함된 물질에 민감했습니다49. 이러한 사실 인정은 COVID-19 환자에 의해 취급된 사탕에서 면봉 견본에 SARS-CoV-2를 검출하는 두 가지 방법을 비교하고 RT-LAMP15에의해 분석된 견본에 있는 25% 더 낮은 억제와 더불어 83% 결과 일치를 찾아낸 최근 연구 결과에 의해 확증됩니다. 또한, GITC-클로로폼 원유 추출은 RT-LAMP와 결합되어 RNA 키트 추출 및 RT-qPCR(재료 표)에 비해 시약 및 공급 비용을 42% 절감하였다.
이 방법을 사용하면 수천 개의 표면 면봉 샘플에 대한 높은 처리량 분석을 허용했습니다. 640개의 샘플을 나타내는 최대 80개의 풀은 RNA 추출에서 RT-LAMP에 의한 SARS-CoV-2 검출까지 2일 동안 처리되었습니다. 제안된 프로토콜은 반정성, 바이러스 RNA의 검출에 국한되고, 감염성 바이러스 입자의 존재를 나타내지 않는다. 추가 분석은 swabbed 표면에 존재하는 감염된 포미트에서 SARS-CoV-2의 전송의 리스크를 평가하기 위하여 요구됩니다.
이 연구는 전염성 질환으로 건강 비상 사태에 직면 했을 때 효과적인 워크플로우를 포함 하는 테스트 전략을 신속 하 게 설정 하는 프로토콜을 제시 합니다. 제안된 샘플링 프로토콜은 간단하고 가정에서 흔히 발견되는 소모품을 사용하며, 바이러스 검출 방법은 열사이클기 대신 수조와 같은 기본 실험실 환경에서 사용할 수 있는 장비에서 수행됩니다. RT-LAMP 시약의 비용은 RT-qPCR에 필요한 비용보다 현저히 낮으며 높은 글로벌 수요 시나리오에 덜 취약합니다. 이 연구는 미래의 전염병 발병과 글로벌 전염병에 환경 바이러스 성 저수지의 평가를위한 프레임 워크 역할을합니다.
The authors have nothing to disclose.
우리는 바이러스 정보 연구소 (VII) 조사관, 박사 앙카 M. 세갈, 윌로우 세갈, 패트리샤 L. 로워, 게리 로워, 캐리 L. 로워, 막다 실비아 피네타, 엘리자베스 크루즈 카노, 박사 그레고리 피터스, 박사 스튜어트 A. 샌딘, 박사 제니퍼 스미스에게 많은 샘플을 수집하기 위해 시간을 복용. 우리는 또한 긍정적인 통제 및 유용한 피드백을 촉진하기위한 샌디에고 캘리포니아 의과 대학 (UCSD)의 소아과부에서 박사 롭 나이트, 잭 길버트 박사, 페드로 발다 – 페레 박사, 박사 사라 알라드 감사합니다. 스테이시 카로타(SDSU 과학대학)와 지나 스피델(SDSU)에게 물류 지원에 감사드리며, 후안 로드리게스는 샘플링 프로토콜의 예술과 그래픽 디자인에 감사드립니다. 우리는 매우 어려운 시기에이 프로젝트에 대한 헌신과 헌신에 대한 모든 참가자들에게 감사드립니다. 이 작품은 조 앤 레인 박사 (SDSU 과학 대학)와 국립 과학 재단 RAPID : SARS-CoV-2 보조금의 환경 저수지 (상 번호 : 2030479)의 관대 한 기부에 의해 지원되었다.
SMP, LIMS, and community outreach: | |||
Authentication Application Programming Interface | Google Sign-In | ||
Commercial hosting platform | GoDaddy | ||
Data Charting Application Programming Interface | Google Charts | ||
Database software | MySQL | ||
Delivery route planning software | Circuit | Circuit for Teams | |
Free email service | Google Email | ||
Geospatial Application Programming Interface | Google Maps API | ||
Multilingual neural machine translation service | Google Translate | ||
Online form | Google Form | ||
Operating system | Linux | ||
Web and database development | Big Rose Web Design | ||
Web server software | Apache | ||
Sampling kit: | |||
Coolers | Coleman (Amazon) | B00363X3F2 | Cost (US$) per 100 rxns: 70 |
Gallon Ziploc bags | Solimo (Amazon) | B07BJ495GL | Cost (US$) per 100 rxns: 18 |
Glycerol (hand sanitizer) | FischerScientific | G33-4 | Cost (US$) per 100 rxns: 9 |
Ice packs | Ice-Brix (Amazon) | B075GLD3X1 | Cost (US$) per 100 rxns: 110 |
Isopropanol (hand sanitizer) | FischerScientific | AA36644K7 | Cost (US$) per 100 rxns: 43 |
KN95 masks | Echo-Sigma | Echo-Sigma | Cost (US$) per 100 rxns: 400 |
Paper for Protocols and Trizol Safety Sheet | Office Depot | 348037 | Cost (US$) per 100 rxns: 36 |
30 mL spray bottles (SDS and hand sanitizer) | Anyumocz (Amazon) | B07T64FHXR | Cost (US$) per 100 rxns: 80 |
RNase, DNase, DNA & PCR inhibitors free Microcentrifuge tubes | Genesee Scientific | 22-281 | Cost (US$) per 100 rxns: 83 |
Sample ID solvent resistant labels | LABTAG | XST-10C1-1WH | Cost (US$) per 100 rxns: 68 |
Swiffer WetJet pads (swabs) | Swiffer (Amazon) | B001F0RBT2 | Cost (US$) per 100 rxns: 8 |
Toothpicks | Kitchen Essential (Amazon) | B00PBK4NG6 | Cost (US$) per 100 rxns: 8 |
Trizol Reagent (guanidinium isothiocyanate solution – GITC), not LS | Invitrogen | 15596018 | Cost (US$) per 100 rxns: 40 |
Tube boxes | Genesee Scientific | 21-119 | Cost (US$) per 100 rxns: 180 |
Small Ziploc bags | Ziploc (Amazon) | B01LRKEI9K | Cost (US$) per 100 rxns: 8 |
Zebra Thermal Transfer Desktop Printer | Zebra | GK420t | |
Total Sampling kit Cost (US$) per 100 rxns: 1,160 | |||
Trizol RNA extraction: | |||
Ammonium Acetate RNase-free | Invitrogen | AM9070G | Cost (US$) per 100 rxns: 2 |
Chloroform | FisherScientific | C298-500 | Cost (US$) per 100 rxns: 2 |
GlycoBlue (glycogen 15 mg/mL) | Invitrogen | AM9515 | Cost (US$) per 100 rxns: 80 |
Molecular-grade absolute (200 proof) Ethanol | FisherScientific | BP2818500 | Cost (US$) per 100 rxns: 30 |
Molecular-grade Isopropanol | FisherScientific | BP2618500 | Cost (US$) per 100 rxns: 3 |
TURBO DNA-free Kit | Invitrogen | AM1907 | Cost (US$) per 100 rxns: 110 |
Multiplexed colorimetric RT-LAMP: | |||
Guanidine Hydrochloride | Alfa Aesar | AAJ6548522 | Cost (US$) per 100 rxns: 1 |
RT-LAMP E1-Primers | IDT | n/a | Cost (US$) per 100 rxns: 7 |
RT-LAMP N2-Primers | IDT | n/a | Cost (US$) per 100 rxns: 7 |
Synthetic SARS-CoV-2 RNA | ATCC | VR-3276SD | Cost (US$) per 100 rxns: 14 |
WarmStart Colorimetric LAMP 2X Master Mix with UDG | NEB | M1800S | Cost (US$) per 100 rxns: 210 |
Eppendorf Mastercycler Pro Thermal Cycler | Eppendorf | 950030010 | |
Total Trizol RNA extraction + LAMP Cost (US$) per 100 rxns: 470 | |||
Kit for RNA extraction: | |||
QIAamp DSP Viral RNA Mini Kit | Qiagen | 61904 | Cost (US$) per 100 rxns: 570 |
RT-qPCR: | |||
Synthetic SARS-CoV-2 RNA | ATCC | VR-3276SD | Cost (US$) per 100 rxns: 14 |
TaqMan Fast Virus 1-Step Master Mix | Applied Biosystems | 4444432 | Cost (US$) per 100 rxns: 180 |
SARS-CoV-2 (2019-nCoV) N1,N2 Primers and Probes | IDT | 10006713 | Cost (US$) per 100 rxns: 20 |
qScript XLT 1-Step RT-qPCR ToughMix | Quantabio | 95132-100 | |
QuantiNova Pathogen | Qiagen | 208652 | |
QuantiNova Probe | Qiagen | 208352 | |
UltraPlex 1-Step ToughMix | Quantabio | 95166-100 | |
CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System | BioRad | 1855196 | |
Kit for RNA extraction + RT-qPCR Cost (US$) per 100 rxns: 790 | |||
RT-PCR: | |||
SuperScript IV One-Step RT-PCR | Invitrogen | 12594025 | |
Lab cleanup: | |||
DNAZap | Invitrogen | AM9890 | |
RNAZap | Invitrogen | AM9780 |