التمايز الموجه للخلايا البطانية الدموية من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات
Summary
يعرض هنا بروتوكول بسيط للتمايز الموجه للخلايا البطانية الدموية من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات في حوالي 1 أسبوع.
Abstract
يتم توزيع الأوعية الدموية في كل مكان داخل جميع أنسجة الجسم وتؤدي وظائف متنوعة. وبالتالي ، فإن اشتقاق الخلايا البطانية الوعائية الناضجة ، التي تبطن لومن الأوعية الدموية ، من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات أمر بالغ الأهمية للعديد من تطبيقات هندسة الأنسجة وتجديدها. في الجسم الحي ، تشتق الخلايا البطانية البدائية من سلالة الأديم المتوسط ويتم تحديدها نحو أنواع فرعية محددة ، بما في ذلك الشرايين والوريدية والشعيرات الدموية والهيموجينية واللمفاوية. تعتبر الخلايا البطانية الدموية ذات أهمية خاصة لأنها ، أثناء التطور ، تؤدي إلى ظهور الخلايا الجذعية والسلفية المكونة للدم ، والتي تولد بعد ذلك جميع سلالات الدم طوال الحياة. وبالتالي ، فإن إنشاء نظام لتوليد الخلايا البطانية الدموية في المختبر من شأنه أن يوفر فرصة لدراسة الانتقال من البطانة إلى المكونة للدم ، وقد يؤدي إلى إنتاج منتجات الدم البشري خارج الجسم الحي وتقليل الاعتماد على المتبرعين البشريين. في حين توجد عدة بروتوكولات لاشتقاق الخلايا البطانية السلفية والبدائية ، لم يتم وصف توليد الخلايا البطانية الدموية ذات الخصائص الجيدة من الخلايا الجذعية البشرية. هنا ، يتم تقديم طريقة لاشتقاق الخلايا البطانية الدموية من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية في حوالي 1 أسبوع: بروتوكول تمايز مع خلايا خط بدائية تشكلت استجابة لمثبط GSK3β (CHIR99021) ، ثم تحريض سلالة الأديم المتوسط بوساطة bFGF ، تليها تطوير الخلايا البطانية البدائية التي يروج لها BMP4 و VEGF-A ، وأخيرا مواصفات الخلايا البطانية الدموية التي يسببها حمض الريتينويك. ينتج عن هذا البروتوكول مجموعة محددة جيدا من الخلايا البطانية الدموية التي يمكن استخدامها لفهم تنظيمها الجزيئي والانتقال من البطانة إلى المكونة للدم ، والتي لديها القدرة على تطبيقها على التطبيقات العلاجية النهائية.
Introduction
الخلايا البطانية (ECs) هي مجموعة غير متجانسة من الخلايا التي تؤدي وظائف متعددة في جميع أنحاء جسم الإنسان وفي الأنسجة المهندسة. بالإضافة إلى دعم وتنظيم أنواع الخلايا الأخرى (مثل خلايا عضلة القلب1 ، الخلايا العظمية2) ، تشمل هذه الوظائف تشكيل حاجز انتقائي بين الدم والأنسجة والمساعدة في تكوين الأنسجة3. يتطلب تمايز ECs الناضجة أثناء التطور الطبيعي مسارات إشارات متنوعة. يتم اشتقاق ECs البدائية من أسلاف الأديم المتوسط ، ثم يتم تحديدها نحو الأنماط الظاهرية الشريانية والوريدية والشعيرية واللمفاويةالناضجة 4. بالإضافة إلى ذلك ، تم تحديد مجموعة فرعية صغيرة من ECs في كيس الصفار خارج الجنين ومنطقة الشريان الأورطي والغدد التناسلية و Mesonephros الجنينية (AGM) لتصبح ECs دموية ، والتي تؤدي إلى ظهور الخلايا الجذعية والسلفية المكونة للدم (HSPCs) التي تهاجر إلى كبد الجنين ونخاع عظم الجنين ، حيث تبقى بعد الولادة وتولد جميع أنواع خلايا الدم طوال الحياة4. تعد المجموعة المتنوعة من الأنماط الظاهرية EC ضرورية لجميع الأنسجة التنموية وصيانتها.
وبالتالي ، فإن ECs ومشتقاتها هي مكونات حاسمة في الدراسات التي تهدف إلى نمذجة وتوضيح آليات التنمية البشرية و / أو المرض ، وكذلك الطب التجديدي وتطبيقات هندسة الأنسجة5،6،7،8. ومع ذلك ، فإن القيد الرئيسي لهذه الأنواع من الدراسات هو عدم توفر ECs البشرية الأولية بالكمية المطلوبة. تشير التقديرات إلى أن ما لا يقل عن 3 × 108 ECs ستكون مطلوبة لغالبية التطبيقات العلاجية6. لحل هذه المشكلة ، تم اقتراح استخدام الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) والخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة البشرية (hiPSCs) نظرا لإمكانات نسبها المتنوعة وقدرتها على توليد أعداد كبيرة من النسل 6,9.
في الواقع ، تم إثبات فائدة الخلايا المشتقة من hESCs أو hiPSCs في دراسات متعددة تركز على نمذجة الأمراض وفحص الأدوية10،11،12. تم استخدام تقنية Organ-on-a-Chip (OOC) لتلخيص فسيولوجيا جسم الإنسان بأمانة أكبر من خلال دمج الخلايا والأنسجة في سقالات ثلاثية الأبعاد. علاوة على ذلك ، يمكن تحقيق اتصال OOCs الفردية المتعددة (ما يسمى بالجسم أو الإنسان على رقاقة ، BOC / HOC) عبر الموائع الدقيقة للسماح بالحديث المتبادل بين الأجهزة ذات الاهتمام13،14،15. الأنسجة الداعمة ، مثل الأوعية الدموية ، هي مكونات حاسمة في OOCs و BOC / HOCs. يسمح دمج الأوعية الدموية بنقل العناصر الغذائية والأكسجين وعوامل paracrine في جميع أنحاء الأنسجة ، وبالتالي تعزيز البيئة المكروية المطلوبة الخاصة بالأنسجة3،12. وبالتالي ، فإن طرق اشتقاق ECs البشرية الناضجة ، مثل ECs الشريانية والوريدية واللمفاوية والدموية ، ضرورية لتطوير مناهج هندسة الأنسجة هذه.
تم نشر بروتوكولات متعددة توضح بالتفصيل خطوات اشتقاق ECs البدائية أو السلفية البشرية من hESCs أو hiPSCs5،16،17،18،19،20،21،22،23،24،25،26 . تعتمد العديد من هذه البروتوكولات على تكوين الجسم الجنيني (EB) أو الاستزراع المشترك ل ESCs / iPSCs مع طبقة مغذية للفئران من الخلايا اللحمية. تميل هذه الاستراتيجيات إلى أن تكون صعبة وتستغرق وقتا طويلا ، مع انخفاض غلة EC و / أو تلوث ECs البشرية بخلايا الفئران. البروتوكولات التي تعتمد بشكل صارم على ثقافة 2D دون استخدام الخلايا اللحمية غالبا ما تتطلب تحريضات طويلة ، واستخدام مجموعات معقدة من عوامل النمو و / أو مثبطات للتحريض ، وتمديد فترات التوسع بعد فصل الخلايا ، أو مزيج من هذه العوامل. يوفر تطوير المعرفة بمسارات الإشارات والعوامل المشاركة في اشتقاق أنواع EC الناضجة في الجسم الحي الأساس لبروتوكول تمايز مباشر وقوي في المختبر.
في السابق ، تم تحديد الأدوار الرئيسية لمسارات إشارات Notch و Retinoic Acid (RA) في مواصفات ECs الشريانية والدموية للفأر ، على التوالي ، أثناء التطوير. يلعب مسار إشارات Notch أدوارا متعددة في مواصفات وصيانة النمط الظاهري الشرياني EC. حدد العمل باستخدام نموذج الأوعية الدموية لشبكية العين في الفئران مسارا يؤدي فيه إجهاد قص السوائل إلى تحفيز محور إشارات Notch-Cx37-p27 ، مما يعزز توقف دورة الخلية G1 ، مما يتيح مواصفات EC الشريانية27. تم افتراض أن حالات دورة الخلية تلعب دورا في قرارات مصير الخلية من خلال توفير نوافذ مميزة من الفرص التي تتقبل فيها الخلايا إشارات معينة يمكن أن تحفز التعبير الجيني وتغيرات النمط الظاهري28. مكن هذا الاعتقال G1 بوساطة Notch من التعبير عن الجينات المخصبة في ECs الشريانية ، بما في ذلك ephrinB2 و Cx40 و DLL4 و Notch1 و Notch 4 (تمت مراجعته في29،30). وقد تبين أيضا أن مواصفات EC الدموية يتم الترويج لها في الجسم الحي عبر إشارات RA31,32. حددت دراسات إضافية أنه ، في اتجاه مجرى إشارات RA ، والتعبير عن c-Kit و Notch upregulation p27 ، مما يتيح المواصفات الدموية في كيس صفار الفئران و AGM33. يمكن تحديد ECs الدموية للفأر إلى الحد الأدنى من خلال التعبير عن كل من علامات البطانية (أي CD31 ، KDR) والمكونة للدم (أي c-Kit ، CD34)4. أخيرا ، تخضع ECs الدموية لانتقال بطاني إلى مكون للدم (EHT) لتشكيل HSPCs ، والتي يمكن أن تؤدي إلى ظهور جميع أنواع خلايا الدم4،34،35.
اختبر العمل الأخير ما إذا كان هذا التسلسل الهرمي للإشارات نفسه يمكن أن يعزز مواصفات EC البشرية المسببة للدم. للقيام بذلك ، تم تطوير بروتوكول زراعة 2D خال من المصل والتغذية لاشتقاق ECs الدموية من hESCs ، وتم تمييز ECs الدموية هذه على مستوى خلية واحدة على أنها CD31 + KDR + c-Kit + CD34 + VE-Cadherin– CD45–. استفادت هذه الدراسة أيضا من مراسل مؤشر دورة الخلية الفلورية في كل مكان (FUCCI) ، والذي يحدد حالات دورة الخلية المختلفة ، باستخدام H9-hESCs التي تعبر عن بناء مراسل FUCCI (H9-FUCCI-hESC)36. في الدراسات التي أجريت على هذه الخلايا ، ثبت أن التهاب المفاصل الروماتويدي يعزز توقف دورة الخلية G1 المبكر في ECs ، وأن حالة G1 المبكرة تمكن من المواصفات الدموية في المختبر37. هنا ، يتم توفير بروتوكول مفصل للتمييز بين هذه الخلايا البطانية البشرية البشرية والمقايسات التي تؤكد هويتها. توفر هذه الطريقة المباشرة وسيلة مفيدة لتوليد هذه المجموعة الفرعية المتخصصة من ECs للدراسات المستقبلية لآليات تطوير خلايا الدم البشرية.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا ، يتم تحديد خطوات إنتاج الخلايا البطانية الدموية من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية في حوالي أسبوع واحد باستخدام نظام زراعة 2D خال من تغذية الفئران والمصل (الشكل 1). يتوسع هذا البروتوكول في طريقة وصفها Sriram et al. (2015) للحصول على ECs38 البدائية. يتم توضيح الطبيعة ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل جزئيا من خلال منح المعاهد الوطنية للصحة HL128064 و U2EB017103. تم تقديم مزيد من الدعم من خلال منحة CT Innovations 15-RMB-YALE-04.
Materials
| 15 cm dishes | Corning | 430599 | tissue culture treated |
| 35 mm dishes | Corning | 430165 | tissue culture treated |
| 6-well plates | Corning | 3516 | tissue culture treated |
| Antimicrobial reagent Brand Name: Normocin |
Invitrogen | ant-nr-1 | |
| bFGF | R&D systems | 233-FB-025 | use at 50 ng/mL |
| BMP4 | BioLegend | 595202 | use at 25 ng/mL |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP1600-1 | |
| Cell Detatchment Solution Brand Name: vAccutase |
Stemcell Technologies | 7920 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | D2650-100mL | |
| Dispase | Stemcell Technologies | 7913 | |
| DLL4 | R&D systems | 1506-D4/CF | recombinant human; use at 10 μg/mL |
| DMEM:F12 | Gibco | 11320-033 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 14190144 | |
| Endothelial cell growth medium Brand Name: EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit (EGM-2) |
Lonza | CC-3162 | |
| FACS tubes | Corning | 352235 | polystyrene round bottom with filter cap |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gemini Bio | 100-106 | |
| Fibronectin | ThermoFisher Scientific | 33016015 | use at 4 mg/cm2 |
| GSK3i/CHIR99021 | Stemgent | 04-0004-02 | 10 mM stock; use at 5 μM |
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14175-095 | |
| Hydrochloric Acid (HCl) | Fisher Scientific | A144S-500 | |
| Matrix protein Brand Name: Matrigel |
Corning | 356230 | Growth factor reduced. Refer to the Certificate of Analysis for the lot to determine the protein (Matrigel) concentration. This concentration is required to calculate the volume of Matrigel that contains 1 mg of protein. |
| Methylcellulose-based medium Brand Name: MethoCult H4435 Enriched |
Stemcell Technologies | 4435 | |
| Pluripotent stem cell differentiation medium Brand Name: STEMdiff APEL 2 |
Stemcell Technologies | 5270 | |
| Pluripotent stem cells: H1, H9, H9-FUCCI | WiCell | WA09 (H9), WA01 (H1) | human; H9-FUCCI were obtained from Dr. Ludovic Vallier's lab at Cambridge Stem Cell Institute |
| Protein-Free Hybridoma Medium (PFMH) | Gibco | 12040077 | |
| Retinoic Acid | Sigma Aldrich | R2625-50mg | use at 0.5 μM |
| Reverse transcription master mix Brand Name: iScript Reverse Transcription Supermix |
BioRad | 1708840 | |
| RNA extraction kit Brand Name: RNeasy Mini Kit |
Qiagen | 74104 | |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Fisher Scientific | SS255-1 | |
| Stem cell growth medium Brand Name: mTeSR1 |
Stemcell Technologies | 85850 | |
| SYBR Green master mix Brand Name: iTaq Universal SYBR Green Master Mix |
BioRad | 1725121 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25299956 | 0.25% |
| VEGF165 (VEGF-A) | PeproTech | 100-20 | use at 50 ng/mL |
| α-CD31-FITC | BioLegend | 303104 | 2 μg/mL* |
| α-CD34-Pacific Blue | BioLegend | 343512 | 2 μg/mL* |
| α-CD45-APC/Cy7 | BioLegend | 304014 | 2 μg/mL* |
| α-c-Kit-APC | BioLegend | 313206 | 2 μg/mL* |
| α-Flk-1-PE/Cy7 | BioLegend | 359911 | 2 μg/mL* |
| α-VE-Cadherin-PE | BioLegend | 348506 | 2 μg/mL* |
| * Antibody fluorescent conjugates should be optimized based on the cell sorter used. Presented here are the final concentrations utilized in this study. | |||
Referências
- Giacomelli, E., et al. Three-dimensional cardiac microtissues composed of cardiomyocytes and endothelial cells co-differentiated from human pluripotent stem cells. Development. 144 (6), 1008-1017 (2017).
- Wu, J., Wu, Z., Xue, Z., Li, H., Liu, J. PHBV/bioglass composite scaffolds with co-cultures of endothelial cells and bone marrow stromal cells improve vascularization and osteogenesis for bone tissue engineering. RSC Advances. 7 (36), 22197-22207 (2017).
- Lee, H., Chung, M., Jeon, N. L. Microvasculature: An essential component for organ-on-chip systems. MRS Bulletin. 39 (1), 51-59 (2014).
- Gritz, E., Hirschi, K. K. Specification and function of hemogenic endothelium during embryogenesis. Cellular and Molecular Life Sciences. 73 (8), 1547-1567 (2016).
- Williams, I. M., Wu, J. C. Generation of endothelial cells from human pluripotent stem cells: Methods, considerations, and applications. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 39 (7), 1317-1329 (2019).
- Olmer, R., et al. Differentiation of human pluripotent stem cells into functional endothelial cells in scalable suspension culture. Stem Cell Reports. 10 (5), 1657-1672 (2018).
- Cossu, G., et al. Lancet Commission: Stem cells and regenerative medicine. The Lancet. 391 (10123), 883-910 (2018).
- Fox, I. J., et al. Use of differentiated pluripotent stem cells in replacement therapy for treating disease. Science. 345 (6199), 1247391 (2014).
- Mahla, R. S. Stem cells applications in regenerative medicine and disease therapeutics. International Journal of Cell Biology. 2016, 1-24 (2016).
- Ebert, A. D., Liang, P., Wu, J. C. Induced pluripotent stem cells as a disease modeling and drug screening platform. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 60 (4), 408-416 (2012).
- Rowe, R. G., Daley, G. Q. Induced pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery. Nature Reviews Genetics. 20 (7), 377-388 (2019).
- Liu, C., Oikonomopoulos, A., Sayed, N., Wu, J. C. Modeling human diseases with induced pluripotent stem cells: from 2D to 3D and beyond. Development. 145 (5), (2018).
- Wnorowski, A., Yang, H., Wu, J. C. Progress, obstacles, and limitations in the use of stem cells in organ-on-a-chip models. Advanced Drug Delivery Reviews. 140, 3-11 (2019).
- Ramme, A. P., et al. Autologous induced pluripotent stem cell-derived four-organ-chip. Future Science OA. 5 (8), 1-12 (2019).
- Ronaldson-Bouchard, K., Vunjak-Novakovic, G. Organs-on-a-Chip: A fast track for engineered human tissues in drug development. Cell Stem Cell. 22 (3), 310-324 (2018).
- Kane, N. M., et al. Derivation of endothelial cells from human embryonic stem cells by directed differentiation: analysis of microrna and angiogenesis in vitro and in vivo. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 30 (7), 1389-1397 (2010).
- Costa, M., et al. Derivation of endothelial cells from human embryonic stem cells in fully defined medium enables identification of lysophosphatidic acid and platelet activating factor as regulators of eNOS localization. Stem Cell Research. 10 (1), 103-117 (2013).
- Nguyen, M. T. X., et al. Differentiation of human embryonic stem cells to endothelial progenitor cells on laminins in defined and xeno-free systems. Stem Cell Reports. 7 (4), 802-816 (2016).
- Ikuno, T., et al. Efficient and robust differentiation of endothelial cells from human induced pluripotent stem cells via lineage control with VEGF and cyclic AMP. PLOS One. 12 (3), 0173271 (2017).
- Aoki, H., et al. Efficient differentiation and purification of human induced pluripotent stem cell-derived endothelial progenitor cells and expansion with the use of inhibitors of ROCK, TGF-B, and GSK3B. Heliyon. 6 (3), 03493 (2020).
- Lian, X., et al. Efficient differentiation of human pluripotent stem cells to endothelial progenitors via small-molecule activation of Wnt signaling. Stem Cell Reports. 3 (5), 804-816 (2014).
- Orlova, V. V., et al. Generation, expansion and functional analysis of endothelial cells and pericytes derived from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 9 (6), 1514-1531 (2014).
- Kusuma, S., Gerecht, S., Turksen, K. Derivation of endothelial cells and pericytes from human pluripotent stem cells. Human Embryonic Stem Cell Protocols. , 213-222 (2014).
- Bao, X., Lian, X., Palecek, S. P. Directed endothelial progenitor differentiation from human pluripotent stem cells via wnt activation under defined conditions. Methods in Molecular Biology. 1481, 183-196 (2016).
- Xu, M., He, J., Zhang, C., Xu, J., Wang, Y. Strategies for derivation of endothelial lineages from human stem cells. Stem Cell Research & Therapy. 10 (1), 200 (2019).
- Arora, S., Yim, E. K. F., Toh, Y. -. C. Environmental specification of pluripotent stem cell derived endothelial cells toward arterial and venous subtypes. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 143 (2019).
- Fang, J. S., et al. Shear-induced Notch-Cx37-p27 axis arrests endothelial cell cycle to enable arterial specification. Nature Communications. 8 (1), 2149 (2017).
- Dalton, S. Linking the cell cycle to cell fate decisions. Trends in Cell Biology. 25 (10), 592-600 (2015).
- Wolf, K., Hu, H., Isaji, T., Dardik, A. Molecular identity of arteries, veins, and lymphatics. Journal of Vascular Surgery. 69 (1), 253-262 (2019).
- Rocha, S. F., Adams, R. H. Molecular differentiation and specialization of vascular beds. Angiogenesis. 12 (2), 139-147 (2009).
- Goldie, L. C., Lucitti, J. L., Dickinson, M. E., Hirschi, K. K. Cell signaling directing the formation and function of hemogenic endothelium during murine embryogenesis. Blood. 112 (8), 3194-3204 (2008).
- Chanda, B., Ditadi, A., Iscove, N. N., Keller, G. Retinoic acid signaling is essential for embryonic hematopoietic stem cell development. Cell. 155 (1), 215-227 (2013).
- Marcelo, K. L., et al. Hemogenic endothelial cell specification requires c-kit, notch signaling, and p27-mediated cell-cycle control. Developmental Cell. 27 (5), 504-515 (2013).
- Dejana, E., Hirschi, K. K., Simons, M. The molecular basis of endothelial cell plasticity. Nature Communications. 8 (1), 14361 (2017).
- Ottersbach, K. Endothelial-to-haematopoietic transition: an update on the process of making blood. Biochemical Society Transactions. 47 (2), 591-601 (2019).
- Pauklin, S., Vallier, L. The cell-cycle state of stem cells determines cell fate propensity. Cell. 155 (1), 135-147 (2013).
- Qiu, J., Nordling, S., Vasavada, H. H., Butcher, E. C., Hirschi, K. K. Retinoic acid promotes endothelial cell cycle early g1 state to enable human hemogenic endothelial cell specification. Cell Reports. 33 (9), 108465 (2020).
- Sriram, G., Tan, J. Y., Islam, I., Rufaihah, A. J., Cao, T. Efficient differentiation of human embryonic stem cells to arterial and venous endothelial cells under feeder- and serum-free conditions. Stem Cell Research & Therapy. 6 (1), 261 (2015).
- Ohta, R., Sugimura, R., Niwa, A., Saito, M. K. Hemogenic endothelium differentiation from human pluripotent stem cells in a feeder- and xeno-free defined condition. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59823 (2019).
- Galat, Y., et al. Cytokine-free directed differentiation of human pluripotent stem cells efficiently produces hemogenic endothelium with lymphoid potential. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 67 (2017).
- Sidney, L. E., Branch, M. J., Dunphy, S. E., Dua, H. S., Hopkinson, A. Concise review: Evidence for CD34 as a common marker for diverse progenitors. Stem Cells. 32 (6), 1380-1389 (2014).
