In vitro Analyse der E3-Ubiquitin-Ligase-Funktion
Summary
Die vorliegende Studie liefert detaillierte In-vitro-Ubiquitylierungs-Assay-Protokolle für die Analyse der katalytischen Aktivität der E3-Ubiquitin-Ligase. Rekombinante Proteine wurden mit prokaryotischen Systemen wie der Escherichia coli-Kultur exprimiert.
Abstract
Die kovalente Bindung von Ubiquitin (Ub) an interne Lysinreste eines Substratproteins, ein Prozess, der als Ubiquitylierung bezeichnet wird, stellt eine der wichtigsten posttranslationalen Modifikationen in eukaryotischen Organismen dar. Die Ubiquitylierung wird durch eine sequentielle Kaskade von drei Enzymklassen vermittelt, darunter Ubiquitin-aktivierende Enzyme (E1-Enzyme), Ubiquitin-konjugierende Enzyme (E2-Enzyme) und Ubiquitin-Ligasen (E3-Enzyme) und manchmal Ubiquitin-Ketten-Dehnungsfaktoren (E4-Enzyme). Hier werden In-vitro-Protokolle für Ubiquitylierungsassays bereitgestellt, die die Beurteilung der E3-Ubiquitin-Ligase-Aktivität, die Zusammenarbeit zwischen E2-E3-Paaren und die Substratauswahl ermöglichen. Kooperierende E2-E3-Paare können durch Überwachung der Erzeugung freier Poly-Ubiquitin-Ketten und/oder der Autoubiquitylierung der E3-Ligase gescreent werden. Die Substratubiquitylierung wird durch selektive Bindung der E3-Ligase definiert und kann durch Western Blotting der In-vitro-Reaktion nachgewiesen werden. Weiterhin wird ein E2~Ub Entladungsassay beschrieben, der ein nützliches Werkzeug zur direkten Beurteilung der funktionellen E2-E3 Kooperation ist. Dabei folgt der E3-abhängige Transfer von Ubiquitin aus dem entsprechenden E2-Enzym auf freie Lysin-Aminosäuren (Nachahmung der Substrat-Ubiquitylierung) oder interne Lysine der E3-Ligase selbst (Auto-Ubiquitylierung). Zusammenfassend werden drei verschiedene In-vitro-Protokolle bereitgestellt, die schnell und einfach durchzuführen sind, um die katalytische Funktionalität der E3-Ligase zu adressieren.
Introduction
Ubiquitylierung ist der Prozess, bei dem Ub kovalent an einSubstratprotein 1gebunden ist. Die Ub-Modifikation wird durch aufeinanderfolgende enzymatische Reaktionen katalysiert, die die Wirkung von drei verschiedenen Enzymklassen beinhalten, d.h.Ub-aktivierende Enzyme (E1s), Ub-konjugierende Enzyme (E2s), Ub-Ligasen (E3s) und möglicherweise Ub-Ketten-Dehnungsfaktoren (E4s)2,3,4,5. Nach Adenosintriphosphat (ATP)- undMagnesium (Mg2+)-abhängiger Aktivierung von Ub durch E1 greift das aktive Zentrum Cystein von E1 das C-terminale Glycin von Ub an und bildet einen Thioesterkomplex (Ub~E1). Die aus der ATP-Hydrolyse gewonnene Energie bewirkt, dass der Ub einen hochenergetischen Übergangszustand erreicht, der während der folgenden Enzymkaskade aufrechterhalten wird. Als nächstes überträgt das E2-Enzym das aktivierte Ub auf sein internes katalytisches Cystein und bildet dadurch eine transiente Ub~ E2-Thioesterbindung. Anschließend wird Ub auf das Substratprotein übertragen.
Dies kann auf zwei Arten geschehen. Entweder kann die E3-Ligase zuerst an E2 binden, oder die E3-Ligase kann Ub direkt binden. Der letztere Weg führt zur Bildung eines E3 ~ Ub-Zwischenprodukts. In beiden Fällen ist Ub mit dem Substratprotein durch Bildung einer Isopeptidbindung zwischen der C-terminalen Carboxylgruppe von Ub und der Lysin-Ɛ-Aminogruppe desSubstrats 6verbunden. Das menschliche Genom kodiert für zwei E1s, etwa 40 E2s und mehr als 600 mutmaßliche Ubiquitinligosen7. Basierend auf dem Ub-Transfermechanismus des E3 werden Ub-Ligasen in drei Kategorien unterteilt, darunter Homolog zum E6AP C-Terminus (HECT)-Typ, Really Interesting New Gene (RING) / U-Box-Typ und RING zwischen RING (RBR) -TypLigasen 8. In dieser Studie wird die Ligase enthaltende U-Box, Carboxyl Terminus of HSC70-interacting Protein (CHIP), als repräsentatives E3-Enzym verwendet. Im Gegensatz zu E3-Enzymen vom HECT-Typ, die Ub~E3-Thioester bilden, bindet die U-Box-Domäne von CHIP E2~Ub und fördert den anschließenden Ub/Substrat-Transfer direkt vom E2-Enzym8,9. Basierend auf der Bedeutung der U-Box für die enzymatische Funktion wird eine inaktive CHIP U-Box-Mutante, CHIP(H260Q), als Kontrolle verwendet. CHIP(H260Q) bindet nicht an seine verwandten E2s und verliert somit seine E3-Ligaseaktivität10.
Die Proteinubiquitylierung spielt eine entscheidende Rolle bei der Regulierung einer Vielzahl zellulärer Ereignisse in eukaryotischen Zellen. Die Vielfalt der zellulären Ergebnisse, die durch die reversible Bindung von Ub-Molekülen an Substratproteine gefördert werden, kann auf die molekularen Eigenschaften von Ub zurückgeführt werden. Da Ub selbst sieben Lysin (K)-Reste zur weiteren Ubiquitylierung enthält, gibt es eine reiche Vielfalt an Ub-Kettentypen mit unterschiedlichen Größen und/oder Topologien11. Zum Beispiel können Substrate durch ein einzelnes Ub-Molekül an einem (Mono-Ubiquitylierung) oder mehreren Lysinen (Multi-Mono-Ubiquitylierung) und sogar durch Ub-Ketten (Poly-Ubiquitylierung) modifiziert werden11. Ub-Ketten werden entweder homo- oder heterotypisch über die gleichen oder unterschiedliche Lysinreste von Ub gebildet, was sogar zu verzweigten Ub-Ketten führen könnte9. Somit führt die Proteinubiquitylierung zu vielfältigen Anordnungen von Ub-Molekülen, die spezifische Informationen liefern, z.B.für den Abbau, die Aktivierung oder die Lokalisation konjugierter Proteine12,13. Diese unterschiedlichen Ub-Signale ermöglichen eine schnelle Reprogrammierung zellulärer Signalwege, was eine wichtige Voraussetzung für die Fähigkeit der Zelle ist, auf sich ändernde Umweltbedürfnisse zu reagieren.
Ein zentraler Aspekt der Ubiquitylierung bezieht sich auf die Proteinqualitätskontrolle. Fehlgefaltete oder irreversibel geschädigte Proteine müssen abgebaut und durch neu synthetisierte Proteine ersetzt werden, um die Proteinhomöostase oder Proteostase aufrechtzuerhalten14. Die Qualitätskontrolle E3 Ligase, CHIP, arbeitet mit molekularen Chaperonen beim Ub-abhängigen Abbau geschädigter Proteine9,15,16,17. Darüber hinaus reguliert CHIP die Stabilität des Myosin-gerichteten Chaperons UNC-45B (Unc-45 Homolog B), das eng auf die Muskelfunktion abgestimmt ist und Abweichungen von den optimalen Werten führen zur menschlichen Myopathie18,19,20,21. Der Abbau von UNC-45B durch das 26S-Proteasom wird durch Anheftung einer K48-verknüpften Poly-Ub-Kette9vermittelt. In Abwesenheit von Substratproteinen führt CHIP eine Autoubiquitylierung10,22,23durch,die für die RING/ U-Box E3-Ubiquitinligosen24,25 charakteristisch ist und die Ligaseaktivitätreguliert 26. Die Anwendung der in diesem Artikel beschriebenen In-vitro-Ubiquitylierungs-Assay-Methoden trug dazu bei, E2-Enzyme systematisch zu identifizieren, die sich mit CHIP zusammenschließen, um die Bildung freier Poly-Ub-Ketten und/oder die Autoubiquitylierung von CHIP zu fördern (Protokollabschnitt 2). Weiterhin wurde eine CHIP-abhängige Ubiquitylierung von UNC-45B beobachtet, welches ein bekanntes Substrat der E3-Ligase18,19 ist (Protokollabschnitt 3). Letztlich wurde die CHIP-abhängige Übertragung von aktiviertem Ub vom Ub~E2-Thioester überwacht (Protokollabschnitt 4).
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieser Beitrag beschreibt grundlegende In-vitro-Ubiquitylierungsmethoden für die Analyse der E3-Ligasefunktion. Bei der Durchführung von In-vitro-Ubiquitylierungsassayles sollte berücksichtigt werden, dass einige E2-Enzyme aufgrund des Angriffs ihres aktiven Cysteins auf ihre eigenen Lysinreste, die sich in unmittelbarer Nähe des aktiven Zentrums befinden, eine Autoubiquitylierung durchführen können30. Um dieses Problem zu umgehen, empfiehlt sich der Einsatz einer E2-Mutan…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken den Mitgliedern unseres Labors für die kritische Diskussion und hilfreiche Beratung zum Manuskript. Wir entschuldigen uns dafür, dass wir aufgrund von Größenbeschränkungen keine wertvollen Beiträge zitiert haben. Diese Arbeit wird gefördert durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) – SFB 1218 – Projektnummer 269925409 und Exzellenzcluster EXC 229/ CECAD bis TH. Diese Arbeit wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) im Rahmen der Exzellenzstrategie – EXC 2030 – 390661388 und – SFB 1218 – Projektnummer 269925409 to T.H. Diese Arbeit wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) im Rahmen der deutschen Exzellenzstrategie – EXC 2030 – 390661388 und – SFB 1218 – Projektnummer: 269925409 an T.H. gefördert.
Materials
| Amershan Protran 0.1 µm NC | GE Healthcare | 10600000 | nitrocellulose membrane |
| Anti-CHIP | Cell Signaling | 2080 | Monoclonal rabbit anti-CHIP antibody, clone C3B6 |
| Anti-MYC | Roche | OP10 | Monoclonal mouse anti-MYC antibody, clone 9E10 |
| Anti-ubiquitin | Upstate | 05-944 | Monoclonal mouse anti-Ub antibody, clone P4D1-A11 |
| Apyrase | Sigma | A6535-100UN | |
| ATP (10x) | Enzo | 12091903 | |
| BSA | Sigma | A6003-10G | |
| EDTA | Roth | 8043.2 | |
| KCl | Roth | 6781.1 | |
| K2HPO4 | Roth | P749.2 | |
| KH2PO4 | Roth | 3904.1 | |
| LDS sample buffer (4x) | novex | B0007 | |
| L-Lysine | Sigma | L5501-5G | |
| MES | Roth | 4256.4 | |
| MeOH | VWR Chemicals | 2,08,47,307 | 100% |
| Milchpulver | Roth | T145.3 | |
| NaCl | Roth | P029.3 | |
| NuPAGE Antioxidant | invitrogen | NP0005 | |
| NuPAGE Transfer buffer (20x) | novex | NP0006-1 | |
| Page ruler plus | Thermo Fisher | 26619 | Protein ladder |
| RotiBlock | Roth | A151.1 | Blocking reagent |
| SDS (20%) | Roth | 1057.1 | |
| S1000 Thermal Cycler | Bio Rad | 1852196 | |
| Trans-Blot Turbo | Bio Rad | 1704150EDU | Transfer system |
| Tris base | Roth | 4855.3 | |
| Tween 20 | Roth | 9127.2 | |
| UbcH Enzyme Set | BostonBiochem | K-980B | E2 enzymes |
| Ubiquitin | BostonBiochem | U-100H | |
| Ubiquitin-activating enzyme E1 | Enzo | BML-UW941U-0050 | |
| Ubiquitylation buffer (10x) | Enzo | BML-KW9885-001 | |
| Whatman blotting paper | Bio Rad | 1703969 | Extra thick filter paper |
Referências
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