시험관 내 E3 유비퀴틴 리가제 기능 분석
Summary
본 연구는 E3 유비퀴틴 리구아제 촉매 활성의 분석을 위한 체외 유비쿼터스 분석 프로토콜에 대한 상세한 제공. 재조합 단백질은 대장균 배양과 같은 원핵계를 사용하여 발현되었다.
Abstract
기판 단백질의 내부 리신 잔류물, 유비쿼터스라고 불리는 공정에 유비퀴틴(Ub)의 공유 부착은 진핵 생물에서 가장 중요한 번역 후 수정 중 하나를 나타냅니다. 유비퀴틸화는 유비퀴틴 활성화 효소(E1 효소), 유비퀴틴-컨쥬게이팅 효소(E2 효소), 유비퀴틴 리구아제(E3 효소) 등 3가지 효소 클래스의 순차적 캐스케이드에 의해 매개되며, 때로는 유비퀴틴 사슬 연공인자(E4 효소)에 의해 매개된다. 여기서, 유비퀴틸레이션 분석용 체외 프로토콜이 제공되어 E3 유비퀴틴 리가제 활성, E2-E3 쌍 간의 협력 및 기판 선택의 평가를 가능하게 한다. E2-E3 쌍의 협력은 E3 리게아제의 무료 폴리 유비퀴틴 체인 및/또는 자동 유비쿼터션의 생성을 모니터링하여 스크리밍할 수 있습니다. 기판 유비쿼터틸레이션은 E3 리게아제의 선택적 결합에 의해 정의되며 체외 반응의 서쪽 블로팅에 의해 검출될 수 있다. 또한, E2~Ub 방전 분석체가 설명되어 있으며, 이는 기능적 E2-E3 협력의 직접적인 평가를 위한 유용한 도구이다. 여기서, 유비퀴틴의 E3 의존적 전달은 해당 E2 효소로부터 자유 리신 아미노산(기판 유비쿼터티화를 모방) 또는 E3 리게아제 자체의 내부 리신(auto-ubiquitylation)에 따른다. 결론적으로, E3 리구아제 촉매 기능을 해결하기 위해 빠르고 수행하기 쉬운 세 가지 다른 체외 프로토콜이 제공됩니다.
Introduction
유비쿼터션은 Ub가 기판 단백질1에공동으로 연결되는 과정입니다. Ub 수정은 세 가지 효소 클래스, 즉Ub 활성화 효소 (E1s), Ub-컨쥬게이팅 효소 (E2s), Ub ligases (E3s), 그리고 아마도 Ub 사슬 연신 요인 (E4s)2,3,4,5의작용을 포함하는 연속적인 효소 반응에 의해 촉매된다. E1에 의한 Ub의 아데노신 트리호스페이트(ATP)와 마그네슘(Mg2+)의존적활성화 후, E1의 활성 부위 시스테인은 Ub의 C-말단 글리신을 공격하여 티오에스테르 복합체(Ub~E1)를 형성한다. ATP 가수분해에서 가져온 에너지는 Ub가 다음과 같은 효소 캐스케이드 전반에 걸쳐 유지되는 높은 에너지 전환 상태를 달성하게 합니다. 다음으로, E2 효소는 활성 Ub를 내부 촉매 시스테인으로 전달하여 일시적인 Ub~E2 티오에스테르 결합을 형성합니다. 이어서, Ub는 기판 단백질로 옮겨질 것입니다.
이 작업은 두 가지 방법으로 수행할 수 있습니다. E3 리개세중 은 먼저 E2에 결합할 수 있거나 E3 리개세는 Ub를 직접 결합할 수 있습니다. 후자의 방법으로 E3~Ub 중간기의 형성이 발생합니다. 두 경우 모두, Ub는 Ub의 C-말단 카복실 그룹과 기판6의리신 아미노 그룹 사이의 이소펩티드 결합의 형성에 의해 기판 단백질에 연결된다. 인간 게놈은 2개의 E1s, 대략 40 E2s 및 600개 이상의 putative 유비퀴틴 리개사7을인코딩합니다. E3의 Ub 전송 메커니즘에 기초하여, Ub ligases는 E6AP C-terminus (HECT) 타입, 정말 흥미로운 새로운 유전자 (RING)/U 박스 형, 그리고 링 (RBR) 형 리게세스8사이의 링에 동종과 관련된 세 가지 범주로 나뉩니다. 본 연구에서는, HSC70-상호작용 단백질(CHIP)의 리구아제, 카르복실 터미누스를 함유한 U-box를 대표적인 E3 효소로 사용한다. Ub~E3 티오에스테르를 형성하는 HECT 형 E3 효소와는 달리, 칩의 U 박스 도메인은 E2~Ub를 결합하고 E2 효소8,9에서직접 후속 Ub/기판 전달을 촉진한다. 효소 기능에 대한 U-box의 중요성을 바탕으로 비활성 CHIP U-box 돌연변이인 CHIP(H260Q)이 컨트롤로 활용됩니다. CHIP(H260Q)은 코그네이트 E2에 결합하지 못해 E3 리구아제 활동10을잃습니다.
단백질 유비쿼터스는 진핵 세포에 있는 세포 사건의 다수를 조절에 있는 중요한 역할을 합니다. 기판 단백질에 Ub 분자의 가역적 인 부착에 의해 촉진되는 세포 결과의 다양성은 Ub의 분자 특성에 기인 할 수있다. Ub 자체가 7개의 리신(K) 잔류물을 함유하고 있기 때문에, 다양한 크기 및/또는토폴로기(11)를가진 다양한 Ub 체인 타입이 있다. 예를 들어, 기판은 단일 Ub 분자(mono-ubiquitylation) 또는 다중 리신(멀티 모노-유비쿼터틸레이션)에 의해, 심지어 Ub 체인(poly-ubiquitylation)11에의해 변형될 수 있다. Ub 체인은 Ub의 동일하거나 다른 리신 잔류물을 통해 일반적으로 형성된 호모 또는 이종성이며, 이는 심지어 분지 된 Ub 체인9의결과를 초래할 수 있습니다. 따라서, 단백질 유비쿼터스는 유목 단백질의 분해, 활성화 또는 국소화를 위한 특정 정보(예:.,12,13)를제공하는 Ub 분자의 다양한 배열로 이어집니다. 이러한 다른 Ub 신호는 변화하는 환경 요구에 대응하는 세포의 능력에 대한 중요한 요구 사항인 세포 신호 경로의 빠른 재프로그래밍을 가능하게 합니다.
유비쿼터스의 중심적인 측면은 단백질 품질 관리와 관련이 있습니다. 잘못 접히거나 돌이킬 수 없는 손상된 단백질은 단백질 항상성 또는프로테오스타증(14)을유지하기 위해 새로 합성된 단백질로 분해되고 대체되어야 한다. 품질 관리 E3 리게아제, CHIP, 손상된 단백질의 Ub 의존 적 분해에분자 샤페론과 협력9,15,16,17. 그 외에도, CHIP은 근육 기능과 편차로 단단히 조정되는 뮤진 주도 샤페론, UNC-45B(UnC-45 Homolog B)의 안정성을 조절하여 인간 근병증18,19,20,21로이어진다. 26S 프로테솜에 의한 UNC-45B의 분해는 K48 연계 폴리-Ub 체인9의부착에 의해 중재된다. 기판 단백질이 없는 경우, CHIP은 링/U-box E3 유비퀴틴 리게아제(24, 25)의 특징인 자동 유비퀴틸레이션10,22,23을수행하며, 리구아제 활성(26)을조절하는 것으로 고려된다. 본 논문에 기재된 체외 유비쿼터션 분석 방법의 적용은 CHIP과 협력하여 CHIP의 무료 폴리-Ub 체인 및/또는 칩의 자동 유비쿼터션(프로토콜 섹션 2)의 형성을 촉진하는 E2 효소를 체계적으로 식별하는 데 도움이 되었습니다. 더욱이, UNC-45B의 칩 의존형 유비쿼터스(ubiquitylation)가 관찰되었으며, 이는 E3 리게아제18,19(프로토콜 섹션 3)의 공지된 기판이다. 궁극적으로, Ub~E2 티오에스테르로부터 활성화된 Ub의 칩 의존적 전송을 모니터링하였다(프로토콜 섹션 4).
Protocol
Representative Results
Discussion
이 논문은 E3 리게아제 기능 의 분석을 위한 기본 체외 보편화 방법을 설명합니다. 시험관 내 유비쿼터티션 어약을 수행할 때, 일부 E2 효소는 활성부위(30)에근접한 자체 리신 잔류물의 공격으로 인해 자동 유비쿼터티화를 수행할 수 있다고 고려해야 한다. 이러한 문제점을 회피하기 위해, 각각의 리신 잔류물이 아르기닌으로 교환되는 E2 돌연변이제를 사용하는 것이…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 원고에 대한 비판적 인 토론과 유용한 조언을 우리 실험실의 회원들에게 감사드립니다. 크기 제한으로 인해 귀중한 기여를 인용하지 않은 것에 대해 사과드립니다. 이 작품은 도이치 포르충스게마인샤프트(DFG, 독일 연구재단)-SFB 1218 – 프로제크넘 269925409 및 우수 EXC 229/CECAD 클러스터에서 TH까지 지원된다. 이 작품은 독일의 우수 전략인 EXC 2030 – 390661388 및 SFB 1218 – Projektnumber 269925409 T.H에 대한 독일의 우수 전략에 따라 도이치 포르스충스게마인샤프트(DFG, 독일 연구 재단)의 지원을 받았습니다. Diese Arbeit wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) im Rahmen der deutschen Exzellenzstrategie – EXC 2030 – 390661388 und – SFB 1218 – Projektnummer: 269925409 T.H. gefördert.
Materials
| Amershan Protran 0.1 µm NC | GE Healthcare | 10600000 | nitrocellulose membrane |
| Anti-CHIP | Cell Signaling | 2080 | Monoclonal rabbit anti-CHIP antibody, clone C3B6 |
| Anti-MYC | Roche | OP10 | Monoclonal mouse anti-MYC antibody, clone 9E10 |
| Anti-ubiquitin | Upstate | 05-944 | Monoclonal mouse anti-Ub antibody, clone P4D1-A11 |
| Apyrase | Sigma | A6535-100UN | |
| ATP (10x) | Enzo | 12091903 | |
| BSA | Sigma | A6003-10G | |
| EDTA | Roth | 8043.2 | |
| KCl | Roth | 6781.1 | |
| K2HPO4 | Roth | P749.2 | |
| KH2PO4 | Roth | 3904.1 | |
| LDS sample buffer (4x) | novex | B0007 | |
| L-Lysine | Sigma | L5501-5G | |
| MES | Roth | 4256.4 | |
| MeOH | VWR Chemicals | 2,08,47,307 | 100% |
| Milchpulver | Roth | T145.3 | |
| NaCl | Roth | P029.3 | |
| NuPAGE Antioxidant | invitrogen | NP0005 | |
| NuPAGE Transfer buffer (20x) | novex | NP0006-1 | |
| Page ruler plus | Thermo Fisher | 26619 | Protein ladder |
| RotiBlock | Roth | A151.1 | Blocking reagent |
| SDS (20%) | Roth | 1057.1 | |
| S1000 Thermal Cycler | Bio Rad | 1852196 | |
| Trans-Blot Turbo | Bio Rad | 1704150EDU | Transfer system |
| Tris base | Roth | 4855.3 | |
| Tween 20 | Roth | 9127.2 | |
| UbcH Enzyme Set | BostonBiochem | K-980B | E2 enzymes |
| Ubiquitin | BostonBiochem | U-100H | |
| Ubiquitin-activating enzyme E1 | Enzo | BML-UW941U-0050 | |
| Ubiquitylation buffer (10x) | Enzo | BML-KW9885-001 | |
| Whatman blotting paper | Bio Rad | 1703969 | Extra thick filter paper |
Referências
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