Introduksjon Analyse av E3 Ubiquitin Ligase-funksjonen
Summary
Den nåværende studien gir detaljerte in vitro ubiquitylation analyseprotokoller for analyse av E3 ubiquitin ligase katalytisk aktivitet. Rekombinante proteiner ble uttrykt ved hjelp av prokaryote systemer som Escherichia coli-kultur.
Abstract
Den kovalente tilknytningen av ubiquitin (Ub) til interne lysinrester av et substratprotein, en prosess som kalles allestedsnærværende, representerer en av de viktigste postoversettelsesendringene i eukaryote organismer. Allestedsnærværende formidler formidles av en sekvensiell kaskade av tre enzymklasser, inkludert allestedsnærværende-aktiverende enzymer (E1 enzymer), allestedsnærværende-konjugaterende enzymer (E2 enzymer) og allestedsnærværende ligaer (E3 enzymer), og noen ganger allestedsnærværende kjedeforlengelsesfaktorer (E4-enzymer). Her gis in vitroprotokoller for allestedsnærværende analyser, som gjør det mulig å vurdere E3 allestedsnærværende ligaer, samarbeidet mellom E2-E3-par og substratvalg. Samarbeidende E2-E3-par kan screenes ved å overvåke genereringen av frie poly-allestedsnærværende kjeder og/eller automatisk allestedsnærværende av E3-ligaene. Substrat allestedsnærværende er definert ved selektiv binding av E3-ligaene og kan påvises ved vestlig blotting av in vitro-reaksjonen. Videre beskrives en E2~Ub utslippsanalyse, som er et nyttig verktøy for direkte vurdering av funksjonelt E2-E3-samarbeid. Her følges den E3-avhengige overføringen av allestedsnærværende fra det tilsvarende E2-enzymet til frie lysinaminosyrer (etterligning av substrat ubiquitylation) eller interne lysiner av selve E3-ligase (auto-allestedsnærværende). Til slutt er det gitt tre forskjellige in vitro-protokoller som er raske og enkle å utføre for å adressere E3-ligase katalytisk funksjonalitet.
Introduction
Allestedsnærværende er prosessen der Ub er kovalent knyttet til et substratprotein1. Ub-modifikasjonen er katalysert av påfølgende enzymatiske reaksjoner som involverer virkningen av tre forskjellige enzymklasser, det vil siUb-aktiverende enzymer (E1s), Ub-konjugaterende enzymer (E2s), Ub ligases (E3s) og muligens Ub-kjedeforlengelsesfaktorer (E4s)2,3,4,5. Etter adenosin triphosfat (ATP)- og magnesium (Mg2+)-avhengig aktivering av Ub ved E1, angriper det aktive stedet cystein av E1 C-terminal glycin av Ub, og danner et thioesterkompleks (Ub ~ E1). Energien trukket fra ATP hydrolyse får Ub til å oppnå en høy energi overgangstilstand, som opprettholdes gjennom følgende enzym kaskade. Deretter overfører E2-enzymet den aktiverte Ub til sin indre katalytiske cystein, og danner dermed en forbigående Ub ~ E2 thioesterbinding. Deretter overføres Ub til substratproteinet.
Dette kan gjøres på to måter. Enten kan E3-ligaen først binde seg til E2, eller E3-ligaene kan binde Ub direkte. Sistnevnte måte resulterer i dannelsen av en E3 ~ Ub mellomliggende. I begge tilfeller er Ub knyttet til substratproteinet ved dannelse av en isopeptidbinding mellom C-terminal karboksylgruppen Ub og lysin- Ɛ-aminogruppen av substratet6. Det menneskelige genomet koder to E1-er, ca. 40 E2-er og mer enn 600 putative allestedsnærværende ligaer7. Basert på Ub-overføringsmekanismen til E3, er Ub-ligaer delt inn i tre kategorier som involverer Homolog til E6AP C-Terminus (HECT)-type, Really Interesting New Gene (RING)/U-box-type og RING mellom RING (RBR)-type ligases8. I denne studien brukes U-boksen som inneholder ligaer, Carboxyl Terminus fra HSC70-interagerende protein (CHIP), som et representativt E3-enzym. I motsetning til HECT-type E3 enzymer som danner Ub ~ E3 tioesters, binder U-box-domenet til CHIP E2 ~ Ub og fremmer den påfølgende Ub / substratoverføringen direkte fra E2-enzymet8,9. Basert på viktigheten av U-boksen for enzymatisk funksjon, brukes en inaktiv CHIP U-boks mutant, CHIP (H260Q), som en kontroll. CHIP(H260Q) klarer ikke å binde seg til sin cognate E2s, og mister dermed sin E3 ligase aktivitet10.
Protein allestedsnærværende spiller en avgjørende rolle i å regulere en rekke cellulære hendelser i eukaryote celler. Mangfoldet av cellulære utfall som fremmes av reversibel vedlegg av Ub-molekyler til substratproteiner, kan tilskrives Ubs molekylære egenskaper. Ettersom Ub selv inneholder syv lysin (K) rester for videre allestedsnærværende, er det rikt utvalg av Ub kjedetyper med forskjellige størrelser og / eller topologier11. For eksempel kan substrater modifiseres av et enkelt Ub-molekyl ved en (mono-allestedsnærværende) eller flere lysiner (multimono-allestedsnærværende), og til og med av Ub-kjeder (poly-allestedsnærværende)11. Ub-kjeder er enten dannet homo- eller heterotypisk via samme eller forskjellige lysinrester av Ub, noe som til og med kan resultere i forgrenedeUb-kjeder 9. Dermed fører protein allestedsnærværende til ulike arrangementer av Ub-molekyler som gir spesifikk informasjon, for eksempelfor nedbrytning, aktivering eller lokalisering av konjugede proteiner12,13. Disse forskjellige Ub-signalene muliggjør rask omprogrammering av cellulære signalveier, noe som er et viktig krav for cellens evne til å reagere på endrede miljøbehov.
Et sentralt aspekt ved allestedsnærværende er relatert til proteinkvalitetskontroll. Feilfoldede eller irreversibelt skadede proteiner må forringes og erstattes av nylig syntetiserte proteiner for å opprettholde protein homeostase eller proteostase14. Kvalitetskontroll E3 ligase, CHIP, samarbeider med molekylære anstander i Ub-avhengig nedbrytning av skadede proteiner9,15,16,17. Bortsett fra det regulerer CHIP stabiliteten til den myosinstyrte anstanden, UNC-45B (Unc-45 Homolog B), som er tett koordinert med muskelfunksjon og avvik fra de optimale nivåene fører til menneskelig myopati18,19,20,21. Nedbrytning av UNC-45B av 26S-proteasomet formidles ved vedlegg av en K48-koblet poly-Ub-kjede9. I fravær av substratproteiner utfører CHIP auto-allestedsnærværende10,22,23, som er karakteristisk for RING / U-boks E3 ubiquitin ligases24,25 og anses å regulere ligase aktivitet26. Anvendelsen av in vitro ubiquitylation analyse metoder beskrevet i dette dokumentet bidro til systematisk å identifisere E2 enzymer som slår seg sammen med CHIP for å fremme dannelsen av frie poly-Ub kjeder og / eller auto-ubiquitylation av CHIP (protokoll avsnitt 2). Videre ble CHIP-avhengig allestedsnærværende ubiquitylation av UNC-45B observert, som er et kjent substrat av E3-ligase18,19 (protokoll § 3). Til slutt ble CHIP-avhengig overføring av aktivert Ub fra Ub ~ E2 thioester overvåket (protokoll avsnitt 4).
Protocol
Representative Results
Discussion
Dette dokumentet beskriver grunnleggende in vitro allestedsnærværende metoder for analyse av E3-ligasefunksjon. Når du utfører in vitro allestedsnærværende analyser, bør det vurderes at noen E2-enzymer kan utføre auto-allestedsnærværende på grunn av angrepet av deres aktive cystein på sine egne lysinrester som ligger i nærheten av det aktive stedet30. For å omgå dette problemet anbefales bruk av en E2-mutant der de respektive lysinrester byttes mot arginin, noe som…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker medlemmene av laboratoriet vårt for kritisk diskusjon og nyttige råd om manuskriptet. Vi beklager at vi ikke har sitert verdifulle bidrag på grunn av størrelsesbegrensning. Dette arbeidet støttes av Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation) – SFB 1218 – Projektnumber 269925409 og Cluster of Excellence EXC 229 / CECAD til TH. Dette arbeidet ble finansiert av Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation) under Tysklands Excellence Strategy – EXC 2030 – 390661388 og – SFB 1218 – Projektnumber 269925409 til T.H. Diese Arbeit wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) im Rahmen der deutschen Exzellenzstrategie – EXC 2030 – 390661388 und – SFB 1218 – Projektnummer: 269925409 en T.H. gefördert.
Materials
| Amershan Protran 0.1 µm NC | GE Healthcare | 10600000 | nitrocellulose membrane |
| Anti-CHIP | Cell Signaling | 2080 | Monoclonal rabbit anti-CHIP antibody, clone C3B6 |
| Anti-MYC | Roche | OP10 | Monoclonal mouse anti-MYC antibody, clone 9E10 |
| Anti-ubiquitin | Upstate | 05-944 | Monoclonal mouse anti-Ub antibody, clone P4D1-A11 |
| Apyrase | Sigma | A6535-100UN | |
| ATP (10x) | Enzo | 12091903 | |
| BSA | Sigma | A6003-10G | |
| EDTA | Roth | 8043.2 | |
| KCl | Roth | 6781.1 | |
| K2HPO4 | Roth | P749.2 | |
| KH2PO4 | Roth | 3904.1 | |
| LDS sample buffer (4x) | novex | B0007 | |
| L-Lysine | Sigma | L5501-5G | |
| MES | Roth | 4256.4 | |
| MeOH | VWR Chemicals | 2,08,47,307 | 100% |
| Milchpulver | Roth | T145.3 | |
| NaCl | Roth | P029.3 | |
| NuPAGE Antioxidant | invitrogen | NP0005 | |
| NuPAGE Transfer buffer (20x) | novex | NP0006-1 | |
| Page ruler plus | Thermo Fisher | 26619 | Protein ladder |
| RotiBlock | Roth | A151.1 | Blocking reagent |
| SDS (20%) | Roth | 1057.1 | |
| S1000 Thermal Cycler | Bio Rad | 1852196 | |
| Trans-Blot Turbo | Bio Rad | 1704150EDU | Transfer system |
| Tris base | Roth | 4855.3 | |
| Tween 20 | Roth | 9127.2 | |
| UbcH Enzyme Set | BostonBiochem | K-980B | E2 enzymes |
| Ubiquitin | BostonBiochem | U-100H | |
| Ubiquitin-activating enzyme E1 | Enzo | BML-UW941U-0050 | |
| Ubiquitylation buffer (10x) | Enzo | BML-KW9885-001 | |
| Whatman blotting paper | Bio Rad | 1703969 | Extra thick filter paper |
Referências
- Kuhlbrodt, K., Mouysset, J., Hoppe, T. Orchestra for assembly and fate of polyubiquitin chains. Essays in Biochemistry. 41, 1-14 (2005).
- Pickart, C. M., Eddins, M. J. Ubiquitin: structures, functions, mechanisms. Biochimica et Biophysica Acta. 1695 (1-3), 55-72 (2004).
- Dye, B. T., Schulman, B. A. Structural mechanisms underlying posttranslational modification by ubiquitin-like proteins. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 36, 131-150 (2007).
- Koegl, M., et al. A novel ubiquitination factor, E4, is involved in multiubiquitin chain assembly. Cell. 96 (5), 635-644 (1999).
- Hoppe, T. Multiubiquitylation by E4 enzymes: ‘one size’ doesn’t fit all. Trends in Biochemical Sciences. 30 (4), 183-187 (2005).
- Stewart, M. D., Ritterhoff, T., Klevit, R. E., Brzovic, P. S. E2 enzymes: more than just the middle men. Cell Research. 26 (4), 423-440 (2016).
- Clague, M. J., Heride, C., Urbé, S. The demographics of the ubiquitin system. Trends in Cell Biology. 25 (7), 417-426 (2015).
- Buetow, L., Huang, D. T. Structural insights into the catalysis and regulation of E3 ubiquitin ligases. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (10), 626-642 (2016).
- French, M. E., Koehler, C. F., Hunter, T. Emerging functions of branched ubiquitin chains. Cell Discovery. 7, 6 (2021).
- Hatakeyama, S., Yada, M., Matsumoto, M., Ishida, N., Nakayama, K. I. U box proteins as a new family of ubiquitin-protein ligases. Journal of Biological Chemistry. 276 (35), 33111-33120 (2001).
- Herhaus, L., Dikic, I. Expanding the ubiquitin code through post-translational modification. EMBO Reports. 16 (9), 1071-1083 (2015).
- Deshaies, R. J., Joazeiro, C. A. RING domain E3 ubiquitin ligases. Annual Review of Biochemistry. 78, 399-434 (2009).
- Hochstrasser, M. Lingering mysteries of ubiquitin-chain assembly. Cell. 124 (1), 27-34 (2006).
- Hoppe, T., Cohen, E. Organismal protein homeostasis mechanisms. Genética. 215 (4), 889-901 (2020).
- Okiyoneda, T., et al. Peripheral protein quality control removes unfolded CFTR from the plasma membrane. Science. 329 (5993), 805-810 (1997).
- Tawo, R., et al. The Ubiquitin ligase CHIP integrates proteostasis and aging by regulation of insulin receptor turnover. Cell. 169 (3), 470-482 (2017).
- Albert, M. C., et al. CHIP ubiquitylates NOXA and induces its lysosomal degradation in response to DNA damage. Cell Death and Disease. 11 (9), 740 (2020).
- Hoppe, T., et al. Regulation of the myosin-directed chaperone UNC-45 by a novel E3/E4-multiubiquitylation complex in C. elegans. Cell. 118 (3), 337-349 (2004).
- Kim, J., Löwe, T., Hoppe, T. Protein quality control gets muscle into shape. Trends in Cell Biology. 18 (6), 264-272 (2008).
- Janiesch, P. C., et al. The ubiquitin-selective chaperone CDC-48/p97 links myosin assembly to human myopathy. Nature Cell Biology. 9 (4), 379-390 (2007).
- Donkervoort, S., et al. Pathogenic variants in the myosin chaperone UNC-45B cause progressive myopathy with eccentric cores. The American Journal of Human Genetics. 107 (6), 1078-1095 (2020).
- Murata, S., Minami, Y., Minami, M., Chiba, T., Tanaka, K. CHIP is a chaperone-dependent E3 ligase that ubiquitylates unfolded protein. EMBO Reports. 2 (12), 1133-1138 (2001).
- Jiang, J., et al. CHIP is a U-box-dependent E3 ubiquitin ligase: identification of Hsc70 as a target for ubiquitylation. Journal of Biological Chemistry. 276 (64), 42938-42944 (2001).
- Yang, Y., Yu, X. Regulation of apoptosis: the ubiquitous way. The FASEB Journal. 17 (8), 790-799 (2003).
- Lamothe, B., et al. TRAF6 ubiquitin ligase is essential for RANKL signaling and osteoclast differentiation. Biochemical and Biophysical Research Communication. 359 (4), 1044-1049 (2007).
- Amemiya, Y., Azmi, P., Seth, A. Autoubiquitination of BCA2 RING E3 ligase regulates its own stability and affects cell migration. Molecular Cancer Research. 6 (9), 1385 (2008).
- Brzovic, P. S., Lissounov, A., Christensen, D. E., Hoyt, D. W., Klevit, R. E. A UbcH5/ubiquitin noncovalent complex is required for processive BRCA1-directed ubiquitination. Molecular Cell. 21 (6), 873-880 (2006).
- Sakata, E., et al. Crystal structure of UbcH5b~ubiquitin intermediate: Insight into the formation of the self-assembled E2~Ub conjugates. Structure. 18 (1), 138-147 (2010).
- Eddins, M. J., Carlile, C. M., Gomez, K. M., Pickart, C. M., Wolberger, C. Mms2-Ubc13 covalently bound to ubiquitin reveals the structural basis of linkage-specific polyubiquitin chain formation. Nature Structural and Molecular Biology. 13 (10), 915-920 (2006).
- Buetow, L., et al. Activation of a primed RING E3-E2 ubiquitin complex by non-covalent ubiquitin. Molecular Cell. 58 (2), 297-310 (2015).
- Dou, H., Buetow, L., Sibbet, G. J., Cameron, K., Huang, D. T. BIRC7-E2 ubiquitin conjugate structure reveals the mechanism of ubiquitin transfer by a RING dimer. Nature Structural and Molecular Biology. 19 (9), 876-883 (2012).
- McKenna, S., et al. Noncovalent interaction between ubiquitin and the human DNA repair protein Mms2 is required for Ubc13-mediated polyubiquitination. Journal of Biological Chemistry. 276 (43), 40120-40125 (2001).
- Plechanovová, A., et al. Mechanism of ubiquitylation by dimeric RING ligase RNF4. Nature Structural Biology. 18 (9), 1052-1059 (2011).
- Pierce, N. W., Kleiger, G., Shan, S. O., Deshaies, R. J. Detection of sequential polyubiquitylation on a millisecond timescale. Nature. 462 (7273), 615-619 (2009).
- Jain, A. K., Barton, M. C. Regulation of p53: TRIM24 enters the RING. Cell Cycle. 8 (22), 3668-3674 (2009).
- Swatek, K. N., Komander, D. Ubiquitin modifications. Cell Research. 26, 399-422 (2016).
- Yan, K., et al. The role of K63-linked polyubiquitination in cardiac hypertrophy. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 22 (10), 4558-4567 (2018).
- Dammer, E. B., et al. Polyubiquitin linkage profiles in three models of proteolytic stress suggest the etiology of Alzheimer disease. Journal of Biological Chemistry. 286 (12), 10457-10465 (2011).
