Protocolo automatizado de dissecção para enriquecimento de tumores em tecidos de baixo teor de tumores
Summary
A anotação digital com dissecção automatizada de tecidos fornece uma abordagem inovadora para enriquecer tumores em casos de baixo teor de tumor e é adaptável tanto parafina quanto para tipos de tecido congelado. O fluxo de trabalho descrito melhora a precisão, a reprodutibilidade e o throughput e pode ser aplicado tanto em pesquisas quanto em configurações clínicas.
Abstract
O enriquecimento tumoral em tecidos de baixo teor de tumores, aqueles abaixo de 20% do conteúdo tumoral dependendo do método, é necessário para gerar dados de qualidade reprodutivelmente com muitos ensaios a jusante, como o sequenciamento de próxima geração. A dissecção automatizada de tecidos é uma nova metodologia que automatiza e melhora o enriquecimento tumoral nesses tecidos comuns e de baixo teor de conteúdo tumoral, diminuindo a imprecisão dependente do usuário das limitações tradicionais de macrodiscção e tempo, custo e experiência da microdisseção de captura a laser usando sobreposição de anotação de imagem digital em slides não manchados. Aqui, as anotações de hematoxilina digital e eosina (H&E) são usadas para atingir pequenas áreas tumorais usando uma lâmina de 250 μmde diâmetro em parafina fixa de formalina não manchada incorporada (FFPE) ou seções congeladas frescas de até 20 μm de espessura para enriquecimento automatizado de tumores antes da extração de ácido nucleico e sequenciamento de exomatos inteiro (WES). A dissecção automatizada pode colher regiões anotadas em tecidos de baixo teor de tumores de seções únicas ou múltiplas para extração de ácido nucleico. Ele também permite a captura de extensas métricas de coleta pré e pós-colheita, melhorando a precisão, a reprodutibilidade e aumentando o throughput com a utilização de menos slides. O protocolo descrito permite a anotação digital com dissecção automatizada em FFPE animal e/ou humano ou tecidos congelados frescos com baixo teor de tumor e também pode ser usado para qualquer região de enriquecimento de interesse para aumentar a adequação para aplicações de sequenciamento a jusante em fluxos de trabalho clínicos ou de pesquisa.
Introduction
O sequenciamento da próxima geração (NGS) é cada vez mais utilizado tanto para o cuidado do paciente quanto para a pesquisa sobre câncer para ajudar a orientar os tratamentos e facilitar a descoberta científica. O tecido é muitas vezes limitado e pequenos espécimes com conteúdo tumoral variável são usados rotineiramente. A adequação e integridade tumorais, portanto, continuam a ser uma barreira para a obtenção de dados significativos. Amostras com menores percentuais tumorais podem causar dificuldade em distinguir variantes verdadeiras de artefatos sequenciamento e são muitas vezes inelegíveis para NGS1. O enriquecimento tumoral de casos de baixo teor de tumores, aqueles abaixo de 20%, tem sido mostrado para ajudar a produzir material suficiente para gerar dados de sequenciamento reprodutível e garantir que variantes de baixa frequência não sejam perdidas 2,3. No entanto, os limites variam dependendo das plataformas utilizadas e do uso planejado dos dados gerados.
Tradicionalmente, o enriquecimento das regiões tumorais para extração é realizado por macrodissecção manual ou microdissecção de captura a laser (LCM) de lâminas de parafina fixa formalina incorporada (FFPE). A macrodisseção manual, ou raspar áreas de tecido especificadas de lâminas, permite que as regiões tumorais sejam removidas para uso em ensaios a jusante com custo relativamente baixo, mas com baixa precisão e baixa precisão 2,4. A precisão técnica mínima pode ser muito eficaz com casos de maior teor de tumores onde grandes faixas de tumor estão presentes e/ou perda mínima de tecido não impacta significativamente os resultados, mas casos de baixo teor de tumores ou casos com tumor mais disperso requerem maior precisão. A LCM foi, portanto, inventada na década de 1990 e tornou-se uma forma valiosa de remover precisamente pequenas, definidas, regiões microscópicas de tecido de lâminas de parafina fixa formalina incorporadas (FFPE) 5,6,7,8. O LCM pode ser utilizado para coletar populações de células únicas quando existe heterogeneidade complexa da amostra9 permitindo a coleta de populações celulares anteriormente difíceis de separar. No entanto, a LCM requer maquinário dispendioso que requer ampla experiência técnica e tempo prático 10,11,12,13,14.
O instrumento utilizado para dissecção automatizada de tecido tem precisão entre a de LCM (~10 μm) e macrodisseções (~1 mm)15. Além disso, apresenta requisitos de custo e perícia técnica entre o de macrodisseção e LCM e foi projetado para realizar o rápido enriquecimento tecidual a partir de lâminas FFPE sequenciais para aliviar as desvantagens dos métodos anteriores15. A dissecção automatizada desta forma utiliza anotações digitais ou sobreposições de imagem de referência de slides no palco em lâminas de tecido não manchadas em série para dissecar e enriquecer regiões de interesse. O instrumento utiliza pontas de fresagem de lâmina giratórias plásticas, tubos de coleta de 1,5 mL e pode ser usado com uma série de fluidos diferentes para dissecção para coletar regiões de interesse para ensaios a jusante, incluindo extração nucleica e sequenciamento. A ponta de moagem de plástico giratório utiliza reservatórios internos e externos de barris de seringa e um êmbolo para coletar tampão, em seguida, moinhos e coleta tecido16. O diâmetro variável do tamanho da ponta de fresagem (250 μm, 525 μm, 725 μm) pode permitir a dissecção de áreas separadas de tecido para comparação, regiões multifocais que podem ser agrupadas ou pequenas áreas individuais de lâminas FFPE únicas ou múltiplas. As espessuras da seção utilizadas para a colheita podem ser ajustadas com base nas necessidades individuais de experimentos e os usuários podem garantir que regiões de interesse não tenham sido esgotadas realizando um H&E adicional em uma seção serial imediatamente após a última seção usada para a colheita.
A dissecção automatizada foi identificada como uma forma de enriquecer o conteúdo tumoral em casos de baixo teor de tumores e testamos e expandimos a funcionalidade pretendida de um instrumento automatizado de dissecção tecidual, que atualmente é comercializado para uso em amostras clínicas FFPE até 10 μm de espessura. O trabalho mostra que a dissecção automatizada pode ser aplicada tanto ao FFPE quanto a seções frescas de tecido humano ou animal congelados até 20 μm de espessura para fins de pesquisa. O protocolo também demonstra uma abordagem para anotar digitalmente e automatizar dissecção para enriquecimento tumoral em tecidos com baixo teor de tumor e/ou casos com tumor aninhado e disperso onde a macrodisseção significativa é desafiadora ou inviável e mostra qualidade e rendimento de ácido nucleico suficiente para NGS. A dissecção automatizada pode, portanto, fornecer precisão de nível médio e aumento da produtividade para o enriquecimento tumoral e também pode ser aplicada para enriquecer outras regiões de interesse ou combinada com outras plataformas para responder a pesquisas ou perguntas clínicas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Apresentado aqui é um protocolo para a aplicação de anotação digital e dissecção automatizada para dissecar regiões tumorais a partir de baixo teor de tumor FFPE ou tecidos congelados frescos para enriquecimento tumoral e uso em WES. A combinação de anotação digital e criação de máscaras com dissecção automatizada reduz significativamente o tempo prático e a experiência necessárias comuns aos métodos clássicos de enriquecimento tumoral, incluindo a macrodisseção manual e lCM. O protocolo demonstra…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostariam de agradecer a Carmina Espiritu e Robin E. Taylor por seu apoio no desenvolvimento de dissecção automatizada, bem como a equipe do Genentech Pathology Core Laboratory que apoiou este trabalho.
Materials
| Agilent SureSelectXT | Agilent | G9611A | |
| AVENIO Millisect Fill Station | Roche | 8106533001 | |
| AVENIO Millisect Instrument, Base | Roche | 8106568001 | |
| AVENIO Millisect Instrument, Head | Roche | 8106550001 | |
| AVENIO Millisect Milling Tips Small | Roche | 8106509001 | |
| AVENIO Millisect PC | Roche | 8106495001 | |
| BioAnalyzer | Agilent | G2939BA | |
| Eppendorf 5427R | Eppendorf | 22620700 | Micro-centrifuge |
| Incubation Buffer | Promega | D920D | |
| Leica Autostainer XL | Leica | ST5010 | Automated stainer |
| Molecular Grade Mineral Oil | Sigma | M5904-500ML | |
| Proteinase K | Promega | V302B | Digestion buffer |
| Qiagen AllPrep DNA/RNA Mini Kit | Qiagen | 80284 | |
| RLT Plus buffer | Qiagen | 80204 | |
| Superfrost Plus positively charged microscope slides | Thermo Scientific | 6776214 |
Referências
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