Protocolo de disección automatizado para el enriquecimiento tumoral en tejidos de bajo contenido tumoral
Summary
La anotación digital con disección automatizada de tejidos proporciona un enfoque innovador para enriquecer el tumor en casos de bajo contenido tumoral y es adaptable tanto a la parafina como a los tipos de tejido congelado. El flujo de trabajo descrito mejora la precisión, la reproducibilidad y el rendimiento y podría aplicarse tanto a la investigación como a los entornos clínicos.
Abstract
El enriquecimiento tumoral en tejidos de bajo contenido tumoral, aquellos por debajo del 20% de contenido tumoral dependiendo del método, es necesario para generar datos de calidad de manera reproducible con muchos ensayos posteriores, como la secuenciación de próxima generación. La disección automatizada de tejidos es una nueva metodología que automatiza y mejora el enriquecimiento tumoral en estos tejidos comunes y de bajo contenido tumoral al disminuir la imprecisión dependiente del usuario de la macrodisección tradicional y las limitaciones de tiempo, costo y experiencia de la microdisección de captura láser mediante el uso de superposición de anotación de imagen digital en diapositivas no teñidas. Aquí, las anotaciones digitales de hematoxilina y eosina (H&E) se utilizan para dirigirse a áreas tumorales pequeñas utilizando una cuchilla de 250 μm2 de diámetro en parafina fija de formalina no teñida incrustada (FFPE) o secciones frescas congeladas de hasta 20 μm de espesor para el enriquecimiento automatizado del tumor antes de la extracción de ácido nucleico y la secuenciación del exoma completo (WES). La disección automatizada puede cosechar regiones anotadas en tejidos de bajo contenido tumoral de secciones únicas o múltiples para la extracción de ácido nucleico. También permite la captura de extensas métricas de recolección antes y después de la cosecha, al tiempo que mejora la precisión, la reproducibilidad y aumenta el rendimiento con la utilización de menos diapositivas. El protocolo descrito permite la anotación digital con disección automatizada en FFPE animal y /o humano o tejidos frescos congelados con bajo contenido tumoral y también podría usarse para cualquier región de enriquecimiento de interés para aumentar la adecuación de las aplicaciones de secuenciación posterior en flujos de trabajo clínicos o de investigación.
Introduction
La secuenciación de próxima generación (NGS) se utiliza cada vez más tanto para la atención del paciente como en la investigación del cáncer para ayudar a guiar los tratamientos y facilitar el descubrimiento científico. El tejido a menudo es limitado y se usan muestras pequeñas con contenido tumoral variable de forma rutinaria. La adecuación y la integridad del tumor, por lo tanto, siguen siendo una barrera para obtener datos significativos. Las muestras con porcentajes tumorales más bajos pueden causar dificultad para distinguir las variantes verdaderas de los artefactos de secuenciación y, a menudo, no son elegibles para NGS1. Se ha demostrado que el enriquecimiento tumoral de casos de bajo contenido tumoral, aquellos por debajo del 20%, ayuda a producir material suficiente para generar datos de secuenciación reproducibles y garantizar que no se pierdan variantes de baja frecuencia 2,3. Sin embargo, los límites variarán dependiendo de las plataformas utilizadas y el uso planificado de los datos generados.
Tradicionalmente, el enriquecimiento de las regiones tumorales para la extracción se realiza mediante macrodisección manual o microdisección de captura láser (LCM) de portaobjetos incrustados de parafina fija de formalina (FFPE). La macrodisección manual, o raspado de áreas de tejido especificadas de diapositivas, permite extirpar regiones tumorales para su uso en ensayos posteriores con un costo relativamente bajo, pero con baja precisión y baja precisión 2,4. La precisión técnica mínima puede ser muy efectiva con casos de mayor contenido tumoral donde grandes franjas de tumor están presentes y / o la pérdida mínima de tejido no afecta significativamente los resultados, pero los casos de bajo contenido tumoral o los casos con tumores más dispersos requieren una mayor precisión. Por lo tanto, LCM se inventó en la década de 1990 y se convirtió en una forma valiosa de eliminar con precisión regiones pequeñas, definidas y microscópicas de tejido de las diapositivas de parafina fija incrustada en formalina (FFPE) 5,6,7,8. LCM se puede utilizar para recolectar poblaciones de células individuales cuando existe heterogeneidad compleja de la muestra9 que permite la recolección de poblaciones celulares previamente difíciles de separar. Sin embargo, LCM requiere maquinaria costosa que requiere una amplia experiencia técnica y tiempo práctico 10,11,12,13,14.
El instrumento utilizado para la disección automatizada de tejidos tiene una precisión entre la de LCM (~10 μm) y las macrodiseecciones (~1 mm)15. Además, exhibe requisitos de costo y experiencia técnica entre el de macrodisección y LCM y está diseñado para realizar un enriquecimiento rápido de tejidos a partir de diapositivas FFPE secuenciales para aliviar las desventajas de los métodos anteriores15. La disección automatizada de esta manera utiliza anotaciones digitales o superposiciones de imágenes de referencia de diapositivas en el escenario en diapositivas de tejido no teñidas en serie para diseccionar y enriquecer las regiones de interés. El instrumento utiliza puntas de fresado de cuchillas giratorias de plástico, tubos de recolección de 1,5 ml y se puede utilizar con una serie de fluidos diferentes para la disección para recolectar regiones de interés para ensayos aguas abajo, incluida la extracción y secuenciación nucleica. La punta de fresado de plástico giratorio utiliza depósitos de barril de jeringa internos y externos y un émbolo para recolectar tampón, luego muele y recolecta tejido16. El diámetro variable del tamaño de la punta de fresado (250 μm, 525 μm, 725 μm) puede permitir la disección de áreas de tejido separadas para la comparación, regiones multifocales que se pueden agrupar o áreas pequeñas individuales de portaobjetos FFPE individuales o múltiples. Los espesores de sección utilizados para la cosecha se pueden ajustar en función de las necesidades individuales del experimento y los usuarios pueden asegurarse de que las regiones de interés no se hayan agotado realizando un H&E adicional en una sección en serie inmediatamente después de la última sección utilizada para la cosecha.
La disección automatizada se identificó como una forma de enriquecer el contenido tumoral en casos de bajo contenido tumoral y probamos y ampliamos la funcionalidad prevista de un instrumento automatizado de disección de tejidos, que actualmente se comercializa para su uso en muestras clínicas FFPE de hasta 10 μm de espesor. El trabajo muestra que la disección automatizada se puede aplicar tanto a FFPE como a secciones de tejido humano o animal fresco congelado de hasta 20 μm de espesor con fines de investigación. El protocolo también demuestra un enfoque para anotar digitalmente y automatizar la disección para el enriquecimiento tumoral en tejidos con bajo contenido tumoral y / o casos con tumor anidado y disperso donde la macrodisección significativa es desafiante o no factible y muestra tanto la calidad como el rendimiento del ácido nucleico suficiente para NGS. Por lo tanto, la disección automatizada puede proporcionar precisión de nivel medio y un mayor rendimiento para el enriquecimiento tumoral y también podría aplicarse para enriquecer otras regiones de interés o combinarse con otras plataformas para responder preguntas clínicas o de investigación.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí se presenta un protocolo para la aplicación de anotación digital y disección automatizada para diseccionar regiones tumorales de FFPE de bajo contenido tumoral o tejidos frescos congelados para el enriquecimiento tumoral y su uso en WES. La combinación de anotación digital y creación de máscaras con disección automatizada reduce significativamente el tiempo práctico y la experiencia requeridos comunes a los métodos clásicos de enriquecimiento tumoral, incluida la macrodisección manual y la LCM. El proto…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer a Carmina Espiritu y Robin E. Taylor por su apoyo en el desarrollo de la disección automatizada, así como al personal del Genentech Pathology Core Laboratory que apoyó este trabajo.
Materials
| Agilent SureSelectXT | Agilent | G9611A | |
| AVENIO Millisect Fill Station | Roche | 8106533001 | |
| AVENIO Millisect Instrument, Base | Roche | 8106568001 | |
| AVENIO Millisect Instrument, Head | Roche | 8106550001 | |
| AVENIO Millisect Milling Tips Small | Roche | 8106509001 | |
| AVENIO Millisect PC | Roche | 8106495001 | |
| BioAnalyzer | Agilent | G2939BA | |
| Eppendorf 5427R | Eppendorf | 22620700 | Micro-centrifuge |
| Incubation Buffer | Promega | D920D | |
| Leica Autostainer XL | Leica | ST5010 | Automated stainer |
| Molecular Grade Mineral Oil | Sigma | M5904-500ML | |
| Proteinase K | Promega | V302B | Digestion buffer |
| Qiagen AllPrep DNA/RNA Mini Kit | Qiagen | 80284 | |
| RLT Plus buffer | Qiagen | 80204 | |
| Superfrost Plus positively charged microscope slides | Thermo Scientific | 6776214 |
Referências
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