Düşük Tümör İçeriği Dokularında Tümör Zenginleştirme için Otomatik Diseksiyon Protokolü
Summary
Otomatik doku diseksiyonu ile dijital ek açıklama, düşük tümör içerikli vakalarda tümörü zenginleştirmek için yenilikçi bir yaklaşım sağlar ve hem parafin hem de dondurulmuş doku tiplerine uyarlanabilir. Açıklanan iş akışı doğruluğu, tekrarlanabilirliği ve verimi artırır ve hem araştırma hem de klinik ortamlara uygulanabilir.
Abstract
Düşük tümör içerikli dokularda tümör zenginleştirme, yönteme bağlı olarak% 20 tümör içeriğinin altında olanlar, yeni nesil dizileme gibi birçok aşağı akış tahlili ile tekrarlanabilir şekilde kaliteli veriler üretmek için gereklidir. Otomatik doku diseksiyonu, lekesiz slaytlar üzerine dijital görüntü ek açıklama bindirmesi kullanarak geleneksel makro-diseksiyonun kullanıcıya bağlı kesinsizliğini ve lazer yakalama mikrodiseksiyonunun zaman, maliyet ve uzmanlık sınırlamalarını azaltarak bu yaygın, düşük tümör içerikli dokularda tümör zenginleştirmesini otomatikleştiren ve geliştiren yeni bir metodolojidir. Burada, dijital hematoksilin ve eozin (H & E) ek açıklamaları, nükleik asit ekstraksiyonu ve tüm ekzom dizilemesi (WES) öncesinde otomatik tümör zenginleştirmesi için boyanmamış formalin sabit parafin gömülü (FFPE) veya kalınlığı 20 μm’ye kadar taze dondurulmuş kesitlerde çapı 250μm olan bir bıçak kullanarak küçük tümör alanlarını hedeflemek için kullanılır. Otomatik diseksiyon, düşük tümör içerikli dokulardaki açıklamalı bölgeleri, nükleik asit ekstraksiyonu için tek veya çoklu bölümlerden toplayabilir. Ayrıca, kapsamlı hasat öncesi ve sonrası toplama ölçümlerinin yakalanmasına olanak tanırken, doğruluğu, tekrarlanabilirliği iyileştirir ve daha az slayt kullanarak verimi artırır. Açıklanan protokol, hayvan ve / veya insan FFPE’si veya düşük tümör içeriğine sahip taze dondurulmuş dokular üzerinde otomatik diseksiyon ile dijital ek açıklama sağlar ve ayrıca klinik veya araştırma iş akışlarında aşağı akış dizileme uygulamaları için yeterliliği artırmak için herhangi bir ilgi alanı zenginleştirme için kullanılabilir.
Introduction
Yeni nesil dizileme (NGS), tedavileri yönlendirmeye ve bilimsel keşfi kolaylaştırmaya yardımcı olmak için hem hasta bakımı hem de kanser araştırmalarında giderek daha fazla kullanılmaktadır. Doku genellikle sınırlıdır ve değişken tümör içeriğine sahip küçük örnekler rutin olarak kullanılır. Bu nedenle, tümör yeterliliği ve bütünlüğü, anlamlı veriler elde etmenin önünde bir engel olmaya devam etmektedir. Daha düşük tümör yüzdelerine sahip örnekler, gerçek varyantları dizileme artefaktlarından ayırt etmede zorluğa neden olabilir ve genellikle NGS 1 için uygundeğildir. Düşük tümör içerikli vakaların tümör zenginleştirilmesinin, %20’nin altındakilerin, tekrarlanabilir dizileme verileri üretmek ve düşük frekanslı varyantların kaçırılmamasını sağlamak için yeterli materyal elde edilmesine yardımcı olduğu gösterilmiştir 2,3. Bununla birlikte, sınırlar kullanılan platformlara ve üretilen verilerin planlanan kullanımına bağlı olarak değişecektir.
Geleneksel olarak, ekstraksiyon için tümör bölgelerinin zenginleştirilmesi, formalin sabit parafin gömülü (FFPE) slaytların manuel makrodiseksiyonu veya lazer yakalama mikrodiseksiyonu (LCM) ile gerçekleştirilir. Manuel makrodiseksiyon veya slaytlardan belirli doku alanlarının kazınması, tümör bölgelerinin aşağı akış tahlillerinde kullanılmak üzere nispeten düşük maliyetli, ancak düşük doğruluk ve düşük hassasiyetle çıkarılmasına izin verir 2,4. Minimal teknik doğruluk, büyük tümör alanlarının bulunduğu ve / veya minimal doku kaybının sonuçları önemli ölçüde etkilemediği daha yüksek tümör içerikli vakalarda çok etkili olabilir, ancak düşük tümör içerikli vakalar veya daha dağınık tümörlü vakalar daha fazla hassasiyet gerektirir. LCM bu nedenle 1990’larda icat edildi ve formalin sabit parafin gömülü (FFPE) slaytlar 5,6,7,8’den dokunun küçük, tanımlanmış, mikroskobik bölgelerini hassas bir şekilde çıkarmak için değerli bir yol haline geldi. LCM, numunenin karmaşık heterojenliği mevcut olduğunda tek hücreli popülasyonları toplamak için kullanılabilir9, daha önce ayrılması zor hücre popülasyonlarının toplanmasına izin verir. Ancak LCM, kapsamlı teknik uzmanlık ve uygulamalı zaman gerektiren maliyetli makineler gerektirir10,11,12,13,14.
Otomatik doku diseksiyonu için kullanılan cihaz, LCM (~10 μm) ile makrodiseksiyonlar (~1 mm)15 arasında hassasiyete sahiptir. Ek olarak, makrodiseksiyon ve LCM arasında hem maliyet hem de teknik uzmanlık gereksinimleri sergiler ve önceki yöntemlerin dezavantajlarını hafifletmek için sıralı FFPE slaytlarından hızlı doku zenginleştirme gerçekleştirmek üzere tasarlanmıştır15. Bu şekilde otomatik diseksiyon, ilgilenilen bölgeleri diseke etmek ve zenginleştirmek için seri olarak kesitlenmiş lekesiz doku slaytları üzerine dijital ek açıklamalar veya sahnede slayt referans görüntüsü kaplamaları kullanır. Cihaz, plastik eğirme bıçağı frezeleme uçları, 1,5 mL toplama boruları kullanır ve nükleik ekstraksiyon ve dizileme dahil olmak üzere aşağı akış analizleri için ilgi çekici bölgeleri toplamak üzere diseksiyon için bir dizi farklı sıvı ile birlikte kullanılabilir. İplik plastik frezeleme ucu, tampon toplamak için iç ve dış şırınga namlu rezervuarları ve bir piston kullanır, ardından doku16’yı frezeler ve toplar. Değişken frezeleme ucu boyutu çapı (250 μm, 525 μm, 725 μm), karşılaştırma için ayrı doku alanlarının, havuzlanabilen çok odaklı bölgelerin veya tek veya çoklu FFPE kızaklarından ayrı küçük alanların diseksiyonuna izin verebilir. Hasat için kullanılan kesit kalınlıkları, bireysel deney ihtiyaçlarına göre ayarlanabilir ve kullanıcılar, hasat için kullanılan son bölümden hemen sonra bir seri bölüm üzerinde ek bir H&E gerçekleştirerek ilgili bölgelerin tükenmemesini sağlayabilir.
Otomatik diseksiyon, düşük tümör içerikli vakalarda tümör içeriğini zenginleştirmenin bir yolu olarak tanımlandı ve şu anda 10 μm kalınlığa kadar FFPE klinik örneklerinde kullanılmak üzere pazarlanan otomatik bir doku diseksiyon cihazının amaçlanan işlevselliğini test ettik ve genişlettik. Çalışma, otomatik diseksiyonun araştırma amacıyla hem FFPE hem de taze dondurulmuş insan veya hayvan dokusu kesitlerine 20 μm kalınlığa kadar uygulanabileceğini göstermektedir. Protokol ayrıca, düşük tümör içeriğine sahip dokularda ve / veya anlamlı makrodiseksiyonun zor olduğu veya mümkün olmadığı iç içe geçmiş, dağınık tümörlü vakalarda tümör zenginleştirme için diseksiyonu dijital olarak açıklama ekleme ve otomatikleştirme yaklaşımını göstermektedir ve NGS için yeterli nükleik asidin hem kalitesini hem de verimini göstermektedir. Bu nedenle otomatik diseksiyon, tümör zenginleştirme için orta düzeyde hassasiyet ve daha fazla verim sağlayabilir ve ayrıca diğer ilgi alanlarını zenginleştirmek için uygulanabilir veya araştırma veya klinik soruları cevaplamak için diğer platformlarla birleştirilebilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada, tümör zenginleştirme ve WES’de kullanım için düşük tümör içerikli FFPE veya taze dondurulmuş dokulardan tümör bölgelerini diseke etmek için dijital ek açıklama ve otomatik diseksiyon uygulaması için bir protokol sunulmaktadır. Dijital ek açıklama ve maske oluşturmayı otomatik diseksiyonla birleştirmek, manuel makrodiseksiyon ve LCM dahil olmak üzere klasik tümör zenginleştirme yöntemlerinde yaygın olan gerekli uygulamalı zamanı ve uzmanlığı önemli ölçüde azaltır. Protokol…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, Carmina Espiritu ve Robin E. Taylor’a otomatik diseksiyon geliştirmedeki destekleri ve bu çalışmayı destekleyen Genentech Patoloji Çekirdek Laboratuvarı personeline teşekkür eder.
Materials
| Agilent SureSelectXT | Agilent | G9611A | |
| AVENIO Millisect Fill Station | Roche | 8106533001 | |
| AVENIO Millisect Instrument, Base | Roche | 8106568001 | |
| AVENIO Millisect Instrument, Head | Roche | 8106550001 | |
| AVENIO Millisect Milling Tips Small | Roche | 8106509001 | |
| AVENIO Millisect PC | Roche | 8106495001 | |
| BioAnalyzer | Agilent | G2939BA | |
| Eppendorf 5427R | Eppendorf | 22620700 | Micro-centrifuge |
| Incubation Buffer | Promega | D920D | |
| Leica Autostainer XL | Leica | ST5010 | Automated stainer |
| Molecular Grade Mineral Oil | Sigma | M5904-500ML | |
| Proteinase K | Promega | V302B | Digestion buffer |
| Qiagen AllPrep DNA/RNA Mini Kit | Qiagen | 80284 | |
| RLT Plus buffer | Qiagen | 80204 | |
| Superfrost Plus positively charged microscope slides | Thermo Scientific | 6776214 |
Referências
- Cho, M., et al. Tissue recommendations for precision cancer therapy using next generation sequencing: a comprehensive single cancer center’s experiences. Oncotarget. 8 (26), 42478-42486 (2017).
- Smits, A. J. J., et al. The estimation of tumor cell percentage for molecular testing by pathologists is not accurate. Modern Pathology: An Official Journal of the United States and Canadian Academy of Pathology, Inc. 27 (2), 168-174 (2014).
- Poole-Wilson, P. A., Langer, G. A. Effect of pH on ionic exchange and function in rat and rabbit myocardium. The American Journal of Physiology. 229 (3), 570-581 (1975).
- Viray, H., et al. A prospective, multi-institutional diagnostic trial to determine pathologist accuracy in estimation of percentage of malignant cells. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 137 (11), 1545-1549 (2013).
- El-Serag, H. B., et al. Gene Expression in Barrett’s Esophagus: Laser capture versus whole tissue. Scandinavian Journal of Gastroenterology. 44 (7), 787-795 (2009).
- Harrell, J. C., Dye, W. W., Harvell, D. M. E., Sartorius, C. A., Horwitz, K. B. Contaminating cells alter gene signatures in whole organ versus laser capture microdissected tumors: a comparison of experimental breast cancers and their lymph node metastases. Clinical & Experimental Metastasis. 25 (1), 81-88 (2008).
- Kim, H. K., et al. Distinctions in gastric cancer gene expression signatures derived from laser capture microdissection versus histologic macrodissection. BMC Medical Genomics. 4, 48 (2011).
- Klee, E. W., et al. Impact of sample acquisition and linear amplification on gene expression profiling of lung adenocarcinoma: laser capture micro-dissection cell-sampling versus bulk tissue-sampling. BMC Medical Genomics. 2, 13 (2009).
- Civita, P., et al. Laser capture microdissection and RNA-seq analysis: High sensitivity approaches to explain histopathological heterogeneity in human glioblastoma FFPE archived tissues. Frontiers in Oncology. 9, 482 (2019).
- Emmert-Buck, M. R., et al. Laser capture microdissection. Science. 274 (5289), 998-1001 (1996).
- Bonner, R. F., et al. Laser capture microdissection: molecular analysis of tissue. Science. 278 (5342), 1481-1483 (1997).
- Hunt, J. L., Finkelstein, S. D. Microdissection techniques for molecular testing in surgical pathology. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 128 (12), 1372-1378 (2004).
- Espina, V., et al. Laser-capture microdissection. Nature Protocols. 1, 586-603 (2006).
- Grafen, M., et al. Optimized expression-based microdissection of formalin-fixed lung cancer tissue. Laboratory Investigation; A Journal of Technical Methods and Pathology. 97 (7), 863-872 (2017).
- Javey, M., et al. innovative tumor tissue dissection tool for molecular oncology diagnostics. The Journal of Molecular Diagnnostics: JMD. (21), 1525-1578 (2021).
- Adey, N., et al. A mill based instrument and software system for dissecting slide-mounted tissue that provides digital guidance and documentation. BMC Clinical Pathology. 13 (1), 29 (2013).
