Automatiserat dissektionsprotokoll för tumöranrikning i vävnader med lågt tumörinnehåll
Summary
Digital anteckning med automatiserad vävnadsdissektion ger ett innovativt tillvägagångssätt för att berika tumör i fall med lågt tumörinnehåll och är anpassningsbart till både paraffin- och frysta vävnadstyper. Det beskrivna arbetsflödet förbättrar noggrannhet, reproducerbarhet och genomströmning och kan tillämpas på både forskning och kliniska miljöer.
Abstract
Tumöranrikning i vävnader med lågt tumörinnehåll, de under 20% tumörinnehåll beroende på metod, krävs för att generera kvalitetsdata reproducerbart med många nedströmsanalyser, såsom nästa generations sekvensering. Automatiserad vävnadsdissektion är en ny metod som automatiserar och förbättrar tumöranrikning i dessa vanliga vävnader med lågt tumörinnehåll genom att minska den användarberoende oprecisionen av traditionell makrodissektion och tids-, kostnads- och expertisbegränsningar för laserfångstmikrodissektion genom att använda digital bildanteckningsöverlägg på oskyddade bilder. Här används digitala hematoxylin- och eosinanteckningar (H&E) för att rikta in sig på små tumörområden med hjälp av ett blad som är 250 μm2 i diameter i oskadad formalinfixerad paraffin inbäddad (FFPE) eller färska frysta sektioner upp till 20 μm i tjocklek för automatiserad tumöranrikning före nukleinsyraextraktion och hel exomsekvensering (WES). Automatiserad dissektion kan skörda kommenterade regioner i vävnader med lågt tumörinnehåll från enstaka eller flera sektioner för nukleinsyraextraktion. Det möjliggör också insamling av omfattande insamlingsmått före och efter skörd samtidigt som noggrannheten, reproducerbarheten och ökar genomströmningen med användning av färre bilder. Det beskrivna protokollet möjliggör digital anteckning med automatiserad dissektion på djur och / eller human FFPE eller färska frysta vävnader med lågt tumörinnehåll och kan också användas för alla regioner av intresseberikning för att öka tillräckligheten för nedströms sekvenseringsapplikationer i kliniska eller forskningsarbetsflöden.
Introduction
Nästa generations sekvensering (NGS) används alltmer för både patientvård och inom cancerforskning för att vägleda behandlingar och underlätta vetenskaplig upptäckt. Vävnaden är ofta begränsad och små prover med varierande tumörinnehåll används rutinmässigt. Tumörtillräcklighet och integritet förblir därför ett hinder för att erhålla meningsfulla data. Prover med lägre tumörprocent kan orsaka svårigheter att skilja sanna varianter från sekvenseringsartefakter och är ofta inte berättigade till NGS1. Tumöranrikning av fall med lågt tumörinnehåll, de under 20%, har visat sig hjälpa till att ge tillräckligt med material för att generera reproducerbara sekvenseringsdata och säkerställa att lågfrekventa varianter inte missas 2,3. Gränserna varierar dock beroende på vilka plattformar som används och planerad användning av de data som genereras.
Traditionellt utförs anrikning av tumörregioner för extraktion genom manuell makrodissektion eller laserfångningsmikrodissektion (LCM) av formalinfixerade paraffininbäddade (FFPE) glidbanor. Manuell makrodissektion, eller skrapning av specificerade vävnadsområden från objektglas, gör att tumörregioner kan avlägsnas för användning i nedströmsanalyser med relativt låg kostnad, men med låg noggrannhet och låg precision 2,4. Minimal teknisk noggrannhet kan vara mycket effektiv med fall med högre tumörinnehåll där stora delar av tumören är närvarande och / eller minimal vävnadsförlust påverkar inte signifikant resultaten, men fall med lågt tumörinnehåll eller fall med mer spridd tumör kräver ökad precision. LCM uppfanns därför på 1990-talet och blev ett värdefullt sätt att exakt ta bort små, definierade, mikroskopiska vävnadsregioner från formalinfixerade paraffininbäddade (FFPE) glid 5,6,7,8. LCM kan användas för att samla in encellspopulationer när komplex heterogenitet hos provet finns9 vilket möjliggör insamling av tidigare svåra att separera cellpopulationer. LCM kräver dock kostsamma maskiner som kräver omfattande teknisk expertis och praktisk tid 10,11,12,13,14.
Instrumentet som används för automatiserad vävnadsdissektion har precision mellan LCM (~ 10 μm) och makrodissektioner (~ 1 mm)15. Dessutom uppvisar den både kostnads- och tekniska expertkrav mellan makrodissektion och LCM och är utformad för att utföra snabb vävnadsanrikning från sekventiella FFPE-objekt för att lindra nackdelarna med tidigare metoder15. Automatiserad dissektion på detta sätt använder digitala anteckningar eller bildreferensbildöverlägg på scenen på seriellt sektionerade oskadade vävnadsglas för dissekering och berikande regioner av intresse. Instrumentet använder frässpetsar av plastspinnblad, 1,5 ml uppsamlingsrör och kan användas med ett antal olika vätskor för dissektion för att samla in regioner av intresse för nedströmsanalyser inklusive nukleisk extraktion och sekvensering. Den snurrande plastfrässpetsen använder inre och yttre sprutfatsbehållare och en kolv för att samla buffert, sedan kvarn och samlar vävnad16. Den variabla frässpetsstorlekens diameter (250 μm, 525 μm, 725 μm) kan möjliggöra dissektion av separata vävnadsområden för jämförelse, multifokala regioner som kan poolas eller enskilda små områden från enstaka eller flera FFPE-objektglas. Sektionstjocklekar som används för skörd kan justeras baserat på individuella experimentbehov och användare kan säkerställa att regioner av intresse inte har tömts genom att utföra ytterligare ett H&E på en seriell sektion omedelbart efter den sista sektionen som används för skörd.
Automatiserad dissektion identifierades som ett sätt att berika tumörinnehållet i fall med lågt tumörinnehåll och vi testade och utökade den avsedda funktionaliteten hos ett automatiserat vävnadsdissektionsinstrument, som för närvarande marknadsförs för användning på FFPE-kliniska prover upp till 10 μm i tjocklek. Arbetet visar att automatiserad dissektion kan appliceras på både FFPE och färska frysta vävnadssektioner för människor eller djur upp till 20 μm i tjocklek för forskningsändamål. Protokollet visar också ett tillvägagångssätt för att digitalt kommentera och automatisera dissektion för tumöranrikning i vävnader med lågt tumörinnehåll och / eller fall med kapslad, dispergerad tumör där meningsfull makrodissektion är utmanande eller inte genomförbar och visar både kvalitet och utbyte av nukleinsyra som är tillräcklig för NGS. Automatiserad dissektion kan därför ge precision på mellannivå och ökad genomströmning för tumöranrikning och kan också tillämpas för att berika andra regioner av intresse eller kombineras med andra plattformar för att svara på forskning eller kliniska frågor.
Protocol
Representative Results
Discussion
Här presenteras ett protokoll för tillämpning av digital annotering och automatiserad dissektion för att dissekera tumörregioner från lågt tumörinnehåll FFPE eller färska frysta vävnader för tumöranrikning och användning i WES. Att kombinera digital anteckning och maskskapande med automatiserad dissektion minskar avsevärt den nödvändiga praktiska tiden och expertisen som är gemensam för klassiska metoder för tumöranrikning inklusive manuell makrodissektion och LCM. Protokollet visar ett potentiellt v…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka Carmina Espiritu och Robin E. Taylor för deras stöd i automatiserad dissektionsutveckling samt Genentech Pathology Core Laboratory-personalen som stödde detta arbete.
Materials
| Agilent SureSelectXT | Agilent | G9611A | |
| AVENIO Millisect Fill Station | Roche | 8106533001 | |
| AVENIO Millisect Instrument, Base | Roche | 8106568001 | |
| AVENIO Millisect Instrument, Head | Roche | 8106550001 | |
| AVENIO Millisect Milling Tips Small | Roche | 8106509001 | |
| AVENIO Millisect PC | Roche | 8106495001 | |
| BioAnalyzer | Agilent | G2939BA | |
| Eppendorf 5427R | Eppendorf | 22620700 | Micro-centrifuge |
| Incubation Buffer | Promega | D920D | |
| Leica Autostainer XL | Leica | ST5010 | Automated stainer |
| Molecular Grade Mineral Oil | Sigma | M5904-500ML | |
| Proteinase K | Promega | V302B | Digestion buffer |
| Qiagen AllPrep DNA/RNA Mini Kit | Qiagen | 80284 | |
| RLT Plus buffer | Qiagen | 80204 | |
| Superfrost Plus positively charged microscope slides | Thermo Scientific | 6776214 |
Referências
- Cho, M., et al. Tissue recommendations for precision cancer therapy using next generation sequencing: a comprehensive single cancer center’s experiences. Oncotarget. 8 (26), 42478-42486 (2017).
- Smits, A. J. J., et al. The estimation of tumor cell percentage for molecular testing by pathologists is not accurate. Modern Pathology: An Official Journal of the United States and Canadian Academy of Pathology, Inc. 27 (2), 168-174 (2014).
- Poole-Wilson, P. A., Langer, G. A. Effect of pH on ionic exchange and function in rat and rabbit myocardium. The American Journal of Physiology. 229 (3), 570-581 (1975).
- Viray, H., et al. A prospective, multi-institutional diagnostic trial to determine pathologist accuracy in estimation of percentage of malignant cells. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 137 (11), 1545-1549 (2013).
- El-Serag, H. B., et al. Gene Expression in Barrett’s Esophagus: Laser capture versus whole tissue. Scandinavian Journal of Gastroenterology. 44 (7), 787-795 (2009).
- Harrell, J. C., Dye, W. W., Harvell, D. M. E., Sartorius, C. A., Horwitz, K. B. Contaminating cells alter gene signatures in whole organ versus laser capture microdissected tumors: a comparison of experimental breast cancers and their lymph node metastases. Clinical & Experimental Metastasis. 25 (1), 81-88 (2008).
- Kim, H. K., et al. Distinctions in gastric cancer gene expression signatures derived from laser capture microdissection versus histologic macrodissection. BMC Medical Genomics. 4, 48 (2011).
- Klee, E. W., et al. Impact of sample acquisition and linear amplification on gene expression profiling of lung adenocarcinoma: laser capture micro-dissection cell-sampling versus bulk tissue-sampling. BMC Medical Genomics. 2, 13 (2009).
- Civita, P., et al. Laser capture microdissection and RNA-seq analysis: High sensitivity approaches to explain histopathological heterogeneity in human glioblastoma FFPE archived tissues. Frontiers in Oncology. 9, 482 (2019).
- Emmert-Buck, M. R., et al. Laser capture microdissection. Science. 274 (5289), 998-1001 (1996).
- Bonner, R. F., et al. Laser capture microdissection: molecular analysis of tissue. Science. 278 (5342), 1481-1483 (1997).
- Hunt, J. L., Finkelstein, S. D. Microdissection techniques for molecular testing in surgical pathology. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 128 (12), 1372-1378 (2004).
- Espina, V., et al. Laser-capture microdissection. Nature Protocols. 1, 586-603 (2006).
- Grafen, M., et al. Optimized expression-based microdissection of formalin-fixed lung cancer tissue. Laboratory Investigation; A Journal of Technical Methods and Pathology. 97 (7), 863-872 (2017).
- Javey, M., et al. innovative tumor tissue dissection tool for molecular oncology diagnostics. The Journal of Molecular Diagnnostics: JMD. (21), 1525-1578 (2021).
- Adey, N., et al. A mill based instrument and software system for dissecting slide-mounted tissue that provides digital guidance and documentation. BMC Clinical Pathology. 13 (1), 29 (2013).
